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.2019年6月3:8:e44423。
doi:10.7554/eLife.44423。

干细胞来源的颅骨和脊髓运动神经元揭示了ALS抗性和敏感性运动神经元之间的蛋白静态差异

迪西安 # 1, 藤木良介 # 2 三 4 5, 迪伦·伊安尼泰利 # 1, 约翰·W·斯默登 6, 舒瓦迪普·梅蒂 1 7, 马修·F·罗斯 2 三 5 8 9 10 11, 阿隆·盖伯 2 三 11, 伊丽莎白·瓦纳塞尔贾 1, 伊洛娜·亚古达耶娃 1, Joun Y Lee（李俊英） 2 三, 克里斯汀·沃格尔 1 7, Hynek Wichterle公司 6, 伊丽莎白·C·恩格尔 2 三 4 5 11 12 13 14, 埃斯特班·奥兰多·马佐尼 1 15
附属公司

干细胞衍生的脑和脊髓运动神经元揭示了ALS抵抗和敏感运动神经元之间的蛋白质平衡差异

迪西安等。 埃利夫. .

摘要

在肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者中，脊髓运动神经元（SpMN）逐渐退化，而颅骨运动神经元（CrMN）的一个亚群则保留到疾病晚期。使用一种快速有效的方法将小鼠胚胎干细胞（ESC）分化为SpMNs和CrMNs，我们现在报告，随着时间的推移，ESC衍生的CrMNs积累的人类（h）SOD1和不溶性p62少于SpMN。ESC衍生的CrMNs具有更高的蛋白酶体活性，可以降解错误折叠的蛋白质，与SpMNs相比，其本质上更能抵抗化学诱导的蛋白质静态应激。蛋白酶体的化学和基因激活可缓解SpMN对蛋白质静态应激的敏感性。一致的是，hSOD1 G93A小鼠模型显示，与SpMNs相比，抗ALS的CrMNs积累的不溶性hSOD 1和p62夹杂物更少。初级衍生抗ALS的CrMNs也比SpMNs更能抵抗蛋白质静态应激。因此，基于ESC的平台已经确定了维持健康蛋白质组的卓越能力，这是抵抗ALS诱导的神经退行性变的可能机制。

关键词：ALS；运动神经元；小鼠；神经科学；再生医学；干细胞分化；干细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

DA、RF、DI、JS、SM、MR、AG、EW、IY、JL、CV、HW、EE、EM未宣布竞争利益

数字

图1。
图1.ESC衍生的iCrMN和iSpMN类似于初级O/TrMN和SpMN的分子和细胞特征。
(A类)来自P100 hSOD1 G93A小鼠的动眼神经细胞和腰部4-5 SpMN的代表性图像。运动神经元被ChAT抗体染色为红色。hSOD1聚集体存在于SpMNs中，并被错误折叠的hSOD1抗体染色为绿色。用于对错误折叠的人SOD1进行成像的共焦激光强度在动眼神经中为2%，在腰椎SpMN中为0.2%（两种运动神经元类型的ChAT成像的激光强度相同）。图1补充图1显示了2%激光强度的木材SpMN中的hSOD1染色(A类). (B)定量hSOD1 G93A小鼠动眼神经细胞和SpMNs中含有hSOD1-聚集体的细胞百分比（n=3只动物，m=40~100，平均值±SD）。(C类)E11.5初级运动神经元分离示意图Isl岛明尼苏达州：绿色荧光粉-阳性小鼠胚胎。采用荧光激活细胞分选（FACS）技术分离、分离和分离初级运动神经元。(D类)初级运动神经元存活实验大纲：在体外第2天、第7天和第14天测量活细胞数（DIV）。初级O/TrMNs存活率高于初级SpMNs（n=4，平均值±SEM）。(E类)ESCs向运动神经元的分化方案：通过直接编程将等基因iNIP和iNIL ESCs分别分化为iCrMNs和iSpMNs。(F类)ESC向运动神经元分化的实验大纲及存活试验。(G公司)iCrMNs存活率高于iSpMNs（n=7–8，平均值±SEM）。(小时)第2-7天ESC衍生运动神经元和DIV七个初级运动神经元的单细胞RNA序列数据的tSNE图。图1-图补充1中显示了按集群标记的相同图(B). (我)所有样本均由代表CrMN与SpMN命运的PC2绘制。n=生物复制；m=每次重复量化的细胞数量；通过学生t检验进行统计分析，p<0.05，p<0.01，**p<0.001。
图1——图补充1。
图1-图补充1。通过单细胞RNA测序对ESC衍生和初级CrMNs和SpMNs的转录组进行比较分析。
(A类)来自P100 hSOD1 G93A小鼠的4-5个SpMN木材的代表性图像，用错折的hSOD1抗体染色，并用共焦激光强度成像，反映用于成像SpMN的0.2%激光强度和用于成像O/TrMN的2.0%激光强度下的同一场。用2%激光强度成像的SpMNs的hSOD1染色高度饱和。(B)根据tSNE图对第2-7天ESC衍生运动神经元和DIV七个初级运动神经元进行聚类。(C类)所有样本均由PC1绘制，代表体外来源与体内来源。(D类)CrMN和SpMN命运标记分别富集于ESC衍生的iCrMNs和iSpMNs中。ESC衍生和初级CrMNs和SpMNs均表达运动神经元标记物Isl1。CrMN命运标记Phox2a和Phox2b在iCrMN和初级O/TrMN中富集，而SpMN命运标志Lhx3和Mnx1/Hb9在iSpMN和主要SpMN中丰富。
图2。
图2：表达类似水平野生型或ALS突变hSOD1蛋白的ESC衍生iCrMNs和iSpMNs的生成。
(A类)表达hSOD1转基因的ESC衍生运动神经元的产生示意图：首先构建了表达野生型（WT）、A4V或G93A hSOD1的转基因ESC系；由此衍生出等基因iNIP和iNIL-ESC细胞系，然后通过直接编程将其分化为运动神经元。 (B)实验大纲：第2天用免疫细胞化学方法对运动神经元进行分化和定量。通过western blot定量分析ESCs和第二天神经元中hSOD1的表达。(C类)使用识别内源性小鼠SOD1（mSOD1）和带有HA标记的外源性hSOD1的SOD1抗体对ESCs进行Western blot分析。(D类)iNIL和iNIP ESCs之间hSOD1表达的定量（n=3，平均值±SD）。(E类)使用SOD1抗体的第二天神经元的蛋白质印迹分析。iCr:iCrMN；国际标准普尔：国际标准普尔MN。(F类)iSpMNs和iCrMNs之间hSOD1表达的量化（n=3，平均值±SD）。ESCs和神经元中外源性hSOD1与内源性mSOD1表达之间的折叠变化的量化如图2补充图1所示。(G公司)用于量化的第二天神经元的代表性图像。所有细胞用DAPI染色，神经元用泛神经标记物TUBB3染色。用HA抗体对hSOD1蛋白进行染色。(小时)TUBB3百分比的量化+第2天的细胞数（n=3，m=~100，平均值±SD）。(我)hSOD1-HA百分比的量化+TUBB3中的单元格+第2天的神经元（n=3，m=~100，平均值±SD）。n=生物复制；m=每个重复量化的细胞数。β-肌动蛋白被用作正常化的负荷控制(D类)和(F类). 虚线表示y=1。通过学生t检验对对数转换数据进行统计分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图2——图补充1。
图2-图补充1。转基因hSOD1变体的过度表达。
(A类)使用iNIL和iNIP ESCs中的SOD1抗体通过western blot定量外源性hSOD1与内源性mSOD1表达之间的倍数变化（n=3，平均值±SD）。 (B)在第2天iCrMNs和iSpMNs中使用SOD1抗体通过western blot定量外源性hSOD1与内源性mSOD1表达之间的倍数变化（n=3，平均值±SD）。n=生物复制；通过学生t检验对对数转换数据进行统计分析，p<0.05，p<0.01，**p<0.001。
图3。
图3：随着时间的推移，iCrMNs积累的突变hSOD1蛋白少于iSpMNs。
(A类)实验大纲：在第2天和第15天，分化运动神经元并用western blot定量hSOD1水平(B)使用HA抗体对第2天和第15天的iCrMNs和iSpMNs进行Western blot分析。hSOD1蛋白的积累显示在可溶性（RIPA）和不溶性（尿素）级分中。iCr:iCrMN；国际标准普尔：国际标准普尔MN。(C类)量化第15天和第2天神经元之间的可溶性hSOD1水平（n=4，平均值±SD）。(D类)第2天和第15天iSpMNs和iCrMNs之间hSOD1积累的量化（n=4，平均值±SD）。可溶性部分中的β-肌动蛋白被用作标准化的负荷控制(C类)和(D类). 虚线表示y=1。n=生物复制；通过学生t检验对对数转换数据进行统计分析，p<0.05，p<0.01，**p<0.001。
图3——图补充1。
图3-图补充1.在iCrMN和iSpMN之间，hSOD1的翻译效率相似。
(A–B)第0天hSOD1 A4V iCrMN的多聚体剖面(A类)和iSpMN(B). (C类)iCrMNs和iSpMNs之间的多聚体相关hSOD1 A4V mRNA和整个hSOD1A4V mRNA的比率相似，由核糖体蛋白RPL19标准化。显示了两个生物复制品和三个技术复制品（平均值±扫描电镜）。通过学生t检验对对数转换数据进行统计分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图4。
图4蛋白酶体依赖性降解减少了iCrMNs中不溶性突变hSOD1的积累。
(A类)实验大纲：在第四天分化运动神经元并用DMSO或100 nM MG-132处理18小时，然后在第五天进行western blot分析(B)使用HA抗体对第5天DMSO或MG-132处理的iCrMNs和iSpMNs进行Western blot分析。hSOD1蛋白在可溶性（RIPA）和不溶性（尿素）组分中积累。iCr、iCrMN；iSp、iSpMN。(C类)MG-132和DMSO处理神经元之间hSOD1积累的定量（n=3，平均值±SD）。可溶性部分中的β-actin用作归一化的负荷控制。虚线表示相等的累加，y=1。n=生物复制；通过双向方差分析和学生t检验对对数转换数据进行统计分析，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。
图5。
图5：iCrMN依赖蛋白酶体功能来减少不溶性蛋白质聚集体的积累。
(A类)实验大纲：在第四天分化运动神经元并用DMSO或100 nM MG-132处理18小时，然后在第五天进行western blot分析(B)使用泛素抗体对第5天DMSO或MG-132处理的iCrMNs和iSpMNs进行的Western blot分析显示，可溶性（RIPA）和不溶性（尿素）组分中存在泛素化蛋白质涂片。iCr、iCrMN；iSp、iSpMN。(C类)MG-132和DMSO处理的神经元之间泛素化蛋白积累的定量（n=3，平均值±SD）。(D类)使用p62抗体对第5天DMSO或MG-132处理的iCrMNs和iSpMNs进行Western blot分析。p62蛋白在可溶性（RIPA）和不溶性（尿素）组分中积累。iCr、iCrMN；iSp、iSpMN。(E类)MG-132和DMSO处理神经元之间p62积累的量化（n=3，平均值±SD）。可溶性组分中的β-肌动蛋白用作标准化的负载对照(C类)和(E类). 虚线表示相等的累加，y=1。n=生物复制；通过双向方差分析和学生t检验对对数转换数据进行统计分析，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。
图6。
图6 ESC和胚性衍生抗ALS的CrMN比SpMN含有更少的p62阳性蛋白聚集体。
(A类)实验大纲：在第四天分化运动神经元并用DMSO或100 nM MG-132处理18小时，然后在第五天进行免疫细胞化学分析；在第15天收集神经元进行western blot分析。 (B)使用p62抗体对第15天神经元进行Western blot分析。p62蛋白在可溶性（RIPA）和不溶性（尿素）组分中积累。iCr、iCrMN；iSp、iSpMN。(C类)第15天iCrMNs和iSpMNs之间p62水平的量化（n=3，平均值±SD）。可溶性部分中的β-actin用作归一化的负荷控制。虚线表示y=1。(D类)非转基因（NT）和hSOD1 G93A小鼠出生后第66、66和97天的同窝鼠动眼神经和腰椎4-5 SpMN的代表性图像。ChAT抗体将运动神经元染成红色。p62抗体将含有p62的内含物染成绿色。(E类)定量hSOD1 G93A小鼠动眼神经细胞和SpMNs中含有p62内含物的细胞百分比（n=3，m=~100，平均值±SD）。(F类)用DMSO或MG-132处理的第五天神经元的代表性图像，DAPI染色为蓝色，p62抗体染色为绿色。右侧显示了含有p62聚集体的细胞百分比的量化（n=3，m=~100，平均值±SD）。n=生物复制品或动物；m=每次重复量化的细胞数量；通过双向方差分析和学生t检验对对数转换数据进行统计分析，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。
图7。
图7：iCrMNs比iSpMNs更能抵抗错误折叠蛋白质引起的蛋白质静态应激。
(A类)实验大纲：从第二天到第五天，用二甲基亚砜或药物对运动神经元进行分化和治疗，并在第五天测量活细胞数量以进行存活分析。 (B)iCrMNs比iSpMNs对衣霉素治疗更具耐药性（n=3-6，平均值±SEM）。(C类)iCrMNs比iSpMNs对CPA治疗更具抵抗力（n=4-5，平均值±SEM）。CPA治疗引起的UPR反应如图7补充图1所示。(D类)iCrMNs比iSpMNs对thapsigargin治疗更具耐药性（n=7-8，平均值±SEM）。(E类)iCrMNs和iSpMNs对布雷菲尔丁A处理同样敏感（n=7–8，平均值±SEM）。n=生物复制；通过学生t检验进行统计分析，p<0.05，p<0.01，**p<0.001。
图7——图补充1。
图7图补充1.CPA处理在iSpMNs中诱导的UPR水平高于iCrMNs。非转基因iCrMNs和iSpMNs在第2天用20μM CPA处理；12小时后，通过RT-qPCR对UPR标记的诱导进行量化。
iSpMNs对sXbp1、Grp78和ATF4的诱导作用高于iCrMNs。ERAD相关基因Hrd1在iCrMNs和iSpMNs之间的诱导水平相似（n=4，平均值±SD）。n=生物复制；通过学生t检验对对数转换数据进行统计分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图7——图补充2。
图7图补充2。CPA处理诱导的额外蛋白静态应激显著增加了iCrMN和iSpMNs中不溶性hSOD1 A4V的积累。从第二天到第五天，表达iCrMNs和iSpMNs的hSOD1 A4V用20μM CPA处理；在第5天通过western定量hSOD1 A4V蛋白的积累。
(A类)使用HA抗体对第5天DMSO或CPA处理的iCrMNs和iSpMNs进行Western blot分析。hSOD1 A4V在可溶性（RIPA）和不溶性（尿素）组分中积累。iCr、iCrMN；iSp、iSpMN。(B)CPA和DMSO处理神经元之间hSOD1积累的量化。(C类)iSpMNs和iCrMNs之间hSOD1积累的量化。n=4，平均值±SD。可溶性部分中的β-actin用作归一化的负荷控制。虚线表示相等的累加，y=1。n=生物复制；通过学生t检验对对数转换数据进行统计分析，p<0.05，p<0.01，**p<0.001。
图8。
图8：原代抗ALS的CrMNs比原代SpMNs更能抵抗蛋白质平衡应激。
(A类)实验大纲：对原代运动神经元进行解剖、分离、分类，并将其置于DIV 0上，用二甲基亚砜或DIV 2至DIV 5的药物进行处理。(B)初级O/TrMNs比初级SpMNs对衣霉素治疗更具耐药性（n=3，平均值±SEM）。(C类)初级O/TrMNs比初级SpMNs对CPA治疗更具耐药性（n=4，平均值±SEM）。n=生物复制；通过学生t检验进行统计分析，p<0.05，p<0.01，**p<0.001。
图9。
图9：iCrMNs包含更多蛋白酶体20S核心亚单位，并且比iSpMNs具有更高的蛋白酶体活性。
(A类)实验大纲：对第二天的神经元进行质谱分析，对第二天和第五天的活神经元进行蛋白酶体活性测试。 (B)无偏质谱分析表明，iCrMNs包含较高水平的所有蛋白酶体20S核心亚基，但不包含19S调节亚基（n=2）。蛋白质组数据如图9源数据1所示。(C类)iCrMNs的蛋白酶体活性高于iSpMNs（通过Suc-LLVY-AMC在活细胞中的水解速率测量）（n=6，平均值±SEM）。n=生物复制；通过学生t检验对对数转换数据进行统计分析，p<0.05，p<0.01，**p<0.001。
图10。
图10：蛋白酶体的化学和遗传激活显著增加了iSpMN在蛋白质静态应激下的存活率。
(A类)实验大纲：用0–10μM PD169316处理第二天神经元18小时后，通过蛋白酶体活性测试测定PD169316.对蛋白酶体的影响。从第二天到第五天，用10μM CPA和DMSO或PD169316共同处理用于存活分析的神经元，并在第五天测量活细胞数量。(B)PD169316增加了iCrMNs和iSpMNs中的蛋白酶体活性（n=4，平均值±SEM）。(C类)0.25–2μM PD169316的治疗对iCrMN和iSpMN的存活率没有影响（n=6，平均值±SEM）。(D类)与单独使用10μM CPA治疗相比，1.75或2μM PD169316与10μM PCA联合治疗可显著提高iSpMN生存率。单独使用10μM CPA的iCrMN存活率与使用10μM CPA和0.75-2μM PD169316的iSpMN生存率之间没有显著差异（n=6，平均值±SEM）。(E类)实验大纲：第1天用表达LacZ对照或PSMB5的慢病毒感染iSpMNs和iCrMNs，然后在第4天用DMSO或30µM CPA治疗，三天后在第7天评估生存率。(F类)PSMB5的病毒表达显著增加了CPA治疗的iSpMN存活率（n=4，平均值±SEM）。所有样本的CPA与DMSO存活率均采用LacZ表达的iSpMNs进行归一化。n=生物复制；通过学生t检验进行统计分析，p<0.05，p<0.01，**p<0.001。
图11。
图11.总结。
利用该平台进行的体外和体内衍生CrMNs和SpMNs的差异易损性研究已确定，保持健康蛋白质组的卓越蛋白质平衡能力是抵抗ALS诱导的神经退行性变的可能机制。
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