STAG2 loss-of-function mutation induces PD-L1 expression in U2OS cells

doi:10.21037/atm.2019.02.23

.2019年4月；7(7):127.

doi:10.1037/atm.2019.02.23。

STAG2功能丧失突变诱导U2OS细胞PD-L1表达

聂志瑞^1 2, 高文文¹, 张燕（音译）¹, 侯玉禾¹, 刘景贤¹, 李兆强¹, 魏雪¹, 叶锡东¹, 金安民²

附属机构

采购管理信息： 31157248
PMCID公司： PMC6511574型
内政部： 10.21037/atm.2019.02.23

STAG2功能丧失突变诱导U2OS细胞PD-L1表达

聂志瑞等。 Ann Transl医学. 2019年4月.

.2019年4月；7（7）：127。

doi:10.21037/atm.2019.02.23。

作者

聂志瑞^1 2, 高文文¹, 张燕（音译）¹, 侯玉禾¹, 刘景贤¹, 李兆强¹, 魏雪¹, 叶锡东¹, 金安民²

附属机构

¹南方医科大学肿瘤研究所，广州510515，中国。
²南方医科大学珠江医院骨科，广州510282。

采购管理信息： 31157248
PMCID公司： PMC6511574型
内政部： 10.21037/atm.2019.02.23

摘要

背景：基质抗原2（STAG2）是一种肿瘤抑制蛋白，在包括膀胱癌、骨肉瘤（OS）和白血病在内的许多肿瘤中反复发生突变或表达缺失。然而，STAG2突变促进肿瘤发生的机制尚不清楚。

方法：通过COSMIC数据库确定肿瘤中STAG2突变的分布；我们还在OS细胞系U2OS细胞中产生了STAG2截断突变，以模拟OS中的常见突变。采用CCK-8法评价STAG2对OS细胞增殖和耐药性的影响。通过细胞凋亡和细胞周期测定来评估STAG2对OS细胞凋亡和周期的影响。使用Illumina Hiseq 2500平台采用高通量RNA测序（RNA-Seq）策略，对STAG2敲除和STAG2 WT OS细胞系的转录组图谱进行了表征。

结果：我们发现STAG2缺陷细胞表现出细胞增殖和生长减少；然而，它们增强了细胞的转移和侵袭，增加了对化疗药物的耐受性。我们还发现，参与肿瘤免疫逃逸的分子PD-L1在SATG2缺失细胞中上调。RNA-seq的表达谱分析表明，许多免疫相关基因的表达发生了变化。

结论：我们的研究结果表明，STAG2有助于提高细胞存活率和对OS顺铂的耐药性，表明STAG2的缺失可能通过增强癌细胞的免疫逃避能力而促进肿瘤的发生。

关键词：PD-L1；基质抗原2（STAG2）；簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9；凝集素；免疫逃避；骨肉瘤（OS）。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：作者没有要声明的利益冲突。

数字

图1
STAG2截断突变抑制细胞增殖并诱导G2/M期阻滞。（A） COSMIC数据库中9种癌症的STAG2突变频率；（B）来自COSMIC数据库的骨癌STAG2突变位点和频率；（C）利用Zhang Lab的在线工具设计STAG2第8外显子缺失的gRNA(http://crispr.mit.edu/); （D） Western blot检测STAG2突变U2OS细胞中SATG2的表达；（E，F）细胞用PI染色，然后用流式细胞仪测定周期分布*P<0.05，***P<0.001乘以T型-测试。（G） CCK-8法检测细胞增殖。细胞以每孔3000个的速度接种在96周的平板中，并通过CCK-8分析测定指定时间点的细胞活力***双向方差分析显示P<0.001。（H） Western blotting检测细胞周期相关蛋白的表达。UT，尿路；HTL、造血和淋巴；NS，神经内分泌癌。

图2
STAG2截断突变增强了细胞迁移能力、顺铂耐药性和PD-L1表达。（A，B）用Transwell室（×200）检测细胞迁移。细胞在无血清培养基的上腔培养。含有10%FBS的培养基的下室用作化学引诱剂。培养14小时后，在显微镜下测定下室的迁移细胞。采用t检验***P<0.001。（C） Western blot分析用于评估E-cadherin和N-cadherin蛋白表达水平的变化以及作为负荷对照的GAPDH。（D）顺铂的剂量-反应曲线。与顺铂梯度剂量孵育24小时后，通过CCK-8分析测定细胞存活率。通过双向方差分析，3个独立实验的数据显示为平均值±SD。***P<0.001。如图所示，用顺铂处理有或无STAG2敲除的（E，F）U2OS细胞。流式细胞仪检测细胞凋亡率。数据表示3个独立实验的平均值±SD*P<0.05，**P<0.01，与对照组相比。（G） RT-PCR检测PD-L1 mRNA表达水平。数据代表3个独立实验的平均值±SD*P<0.05T型-测试。（H）使用蛋白质印迹分析来评估PD-L1蛋白表达水平的变化和GAPDH作为负载对照。（一）通过FACS分析测定U2-OS WT和KO细胞中PD-L1的表达（开放型、抗PD-L1抗体、填充型、阴性对照）。所有数据均代表3个独立实验。

图3
STAG2-loss细胞中细胞外基质组织和免疫反应相关基因的表达发生改变。（A）上调和下调DEG的火山图。火山图显示了STAG2 KO组和STAG2 WT组视网膜的上调和下调差异表达基因（DEG）。对于每个图，x轴表示对数2倍变化（FC），y轴表示−log10（P值）。DESeq中发现的调整后P值小于0.05的基因被指定为差异表达（进行了两次生物复制）。紫色点是CXCL14和MMP3基因。（B）与STAG2 WT组相比，STAG2 KO组中前10个丰富的GO术语。调整后P值小于0.05的强化GO术语被视为显著强化（*调整后P<0.05）。（C）与STAG2 WT组相比，STAG2 KO组差异表达基因（DEG）的前20个丰富的京都基因和基因组百科全书（KEGG）路径。经调整的P值小于0.05的富集途径被认为是显著富集的（*经调整的P＜0.05）。（D） STAG2缺陷细胞和亲代细胞中PI3K/Akt通路相关蛋白的Western blot分析。GAPDH被用作加载控制。它是三个独立实验的代表。*表明3个独立细胞样本的基因表达水平存在显著差异。

**图S1**
基于RNA-seq的定位可生成U2-OS KO和WT细胞的STAG2位点表达谱。虚线框表示被CRISPR-Cas9删除的外显子8的位置。

**图S2**
CXXL14和MMP3在不同肿瘤类型中的表达——生存分析。（A，B）使用人类蛋白图谱门户网站的数据，通过K均值（K=3）方法对患者分层绘制Kaplan-Meier图，将宫颈癌和结直肠癌患者分为CXCL14低表达组和高表达组。（C，D）Kaplan-Meier图绘制于采用K均值（K=3）方法分层的患者，利用人类蛋白图谱门户网站的数据将宫颈癌和胰腺癌患者分为MMP3低表达组和高表达组。所有数据均为原始数据，可在人类蛋白质图谱门户网站上获取(www.proteinalas.org/dictionary网站). 经人类蛋白质图谱许可发布。

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