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.2019年7月30日；93（16）：e00595-19。
doi:10.1128/JVI.00595-19。 2019年8月15日印刷。

BK多瘤病毒感染的时间蛋白质组分析显示病毒诱导G2天然免疫传感的捕获与高效规避

劳拉·G·卡勒 # 1, 科林·T·R·戴维斯 # 2, 罗宾·安特罗布斯 2, 保罗·莱纳 2, 迈克尔·P·威克斯 三, 科林·M·克拉姆 4
附属公司

BK多瘤病毒感染的时间蛋白质组分析显示病毒诱导G2天然免疫传感的捕获与高效规避

劳拉·G·卡勒等。 J维罗尔. .

摘要

BK多瘤病毒（BKPyV）是一种小型DNA病毒，可在大多数人的泌尿道形成终身持续感染。已知BKPyV会导致肾移植受者严重发病，并可能导致移植排斥反应。简单的5.2-kbp双链DNA（dsDNA）基因组只表达7种已知蛋白质；因此，它严重依赖主机进行复制。宿主蛋白质组在感染过程中的变化是理解这种宿主病毒相互作用的关键。在这里，首次使用时间定量病毒组学来量化BKPyV感染72小时内两种主要人类上皮细胞中9000多种宿主蛋白的全球变化。这些数据证明了细胞周期进展和假G的重要性2阻断BKPyV的有效复制，同时在整个病毒复制周期中惊人地缺乏先天免疫反应。因此，BKPyV以复杂的方式逃避病原体识别，以阻止先天免疫反应的激活。重要性BK多瘤病毒可导致免疫抑制患者出现严重问题，尤其是肾移植患者，他们可能会发展为多瘤病毒相关肾病。在这项工作中，我们使用先进的蛋白质组学技术来确定在该病毒的整个复制周期中，人类泌尿道两种独立的原代细胞类型（肾脏和膀胱）感染引起的蛋白质表达变化。我们的发现揭示了这种病毒引起的一种特定形式的细胞周期阻滞的新细节，而且，重要的是，我们已经确定这种病毒具有显著的逃避宿主细胞防御系统检测的能力。此外，我们的数据为未来研究肾上皮细胞及其受泌尿系病原体感染提供了重要资源。

关键词：细胞周期；免疫逃避；先天免疫；多瘤病毒；蛋白质组学。

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数字

图1
图1
BK多瘤病毒裂解感染的定量时间分析。（A） 实验工作流程示意图。RPTE和HU细胞（分别为RPTEC和HUC）在MOI为5或模拟感染时被感染。全细胞裂解物（WCL）在24、48和72时收获 h（感染样本）或24和72 h（模拟感染样本）。（B） 所有定量蛋白质的层次聚类分析。（C） RPTE和HU细胞中24、48和72 hpi下所有蛋白质的散点图。与相同细胞类型模拟感染的平均对应值相比，显示了折叠变化。Benjamini-Hochberg修正显著性B用于估计P（P）值（51）。（D） 散点图显示了BKPyV感染的RPTE和HU细胞中蛋白质丰度变化之间的相关性，以及RPTE和HU细胞之间上调和下调>2倍的蛋白质重叠。（E） 确定的5种病毒蛋白的时间分布，最多归一化为一种。
图2
图2
在RPTE细胞中重复定量时间剖面分析（实验2）。（A） 实验2的实验工作流程示意图。（B） 量化所有蛋白质的散点图。与模拟感染的平均对应值相比，显示了折叠变化。Benjamini-Hochberg修正显著性B用于估计P（P）值（51）。（C） 实验1和实验2之间定量的蛋白质重叠。（D） 散点图显示RPTE细胞中实验1和实验2与由≥2肽定量的蛋白质之间的相关性。（E） 定量的5种病毒蛋白的时间分布，标准化为最大1。
图3
图3
在BKPyV感染期间，参与先天性抗病毒免疫反应的蛋白质保持不变。（A） 少数具有天然抗病毒功能的蛋白质上调或下调（UniProt关键字、天然免疫和抗病毒）。（B） 来自面板A中数据的蛋白质剖面示例。（C）通过Western blotting验证面板B中显示的时间剖面。RPTE细胞被模拟感染或以3的MOI感染BKPyV或用IFN-α2A（104U/ml）并通过Western blotting分析所示蛋白质。
图4
图4
RPTE细胞磷酸化IRF3并转位IRF3，以响应细胞质RNA和DNA，但在BKPyV感染时未能做到这一点。（A） 刺激后IRF3定位变化的免疫荧光显微镜分析。感染BKPyV（MOI为0.5）或模拟感染的RPTE细胞固定在48 hpi。poly（I·C）刺激RPTE细胞（2 μg/ml）或刺激DNA（2 μg/ml）固定在6 刺激后h。DAPI作为核标记物，抗VP1作为感染标记物。（B） 免疫印迹法分析IRF3磷酸化。RPTE细胞感染BKPyV（MOI为3）或模拟感染，并在48 hpi时收获。poly（I·C）刺激RPTE细胞（2 μg/ml）或刺激DNA（2 μg/ml） 刺激后h。
图5
图5
BKPyV和模拟感染的RPTE细胞对细胞质RNA和DNA的反应没有差异。（A） 免疫荧光显微镜分析BKPyV感染或未感染细胞刺激后IRF3定位的变化。用poly（I·C）（2）刺激感染BKPyV（MOI为0.5）或模拟感染的RPTE细胞 μg/ml）或寡聚DNA（2 μg/ml），并固定在48 hpi。DAPI被用作核标志物，抗LTAg被用作感染的标志物。（B） 通过Western blotting分析BKPyV感染或未感染细胞刺激后IRF3磷酸化。用poly（I·C）（2）刺激感染BKPyV（MOI of 3）或模拟感染的RPTE细胞 μg/ml）或寡聚DNA（2 μg/ml），在42 hpi时采集，在48 hpi时收获。
图6
图6
上调的蛋白质富含细胞周期功能。（A） 在实验1中量化的所有8985种人类蛋白质的背景下，对上调或下调的蛋白质进行DAVID富集分析>2倍。HU细胞未观察到显著富集的下调簇。（B） RPTE和HU细胞的选定细胞周期相关蛋白的示例蛋白质谱。蛋白质家族被彩色盒子分隔开。（C） 通过Western blotting（RPTE细胞；MOI of 3）验证面板B中显示的选定时间剖面。Tubulin用作负荷对照，VP1用作感染对照。
图7
图7
MDM2和p53通过LTAg依赖性和非依赖性活动被BKPyV调节。（A） 感染BKPyV（MOI of 1）或模拟感染的RPTE细胞中MDM2、p53和LTAg的表达，然后用5 μM Nutlin-3或DMSO作为2 hpi的对照，固定为48 hpi。DAPI被用作核标记物。（B） 转染BKPyV LTAg的RPTE细胞中MDM2、p53和LTAg表达，然后用5 μM Nutlin-3或DMSO作为2的对照 h并受到细胞周期抑制（5 μM RO-3306），24 h、 固定在48 h后转染。DAPI被用作核标记物。针对每个条件显示了五个示例单元格。
图8
图8
细胞周期抑制剂对BKPyV诱导的G2/M期细胞周期阻滞。（A） 在一些不同的实验条件下测定了RPTE细胞的细胞周期状态。RPTE细胞感染BKPyV（MOI为3）或模拟感染，然后受到CDK4/6抑制（1 μM PD0332991），CDK1/2抑制（20 μM Roscovitine）或CDK1抑制（5 μM RO-3306）在24hpi时进行；随后在48hpi时收集细胞进行分析。收集的细胞用碘化丙啶（PI）染色并用流式细胞仪分析(n个 = 3). 误差线表示标准偏差*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01***P（P） < 0.001; ns，不显著（两个样本t吨G中细胞比例变化测试1). （B） 显示了单个实验的每个实验条件下的PI染色直方图。（C） 细胞活力测试。RPTE细胞用1 μM PD0332991，20 μM玫瑰碱，或5 24μM RO-3306 h，然后根据制造商的方案进行台盼蓝排除试验(n个 = 3).
图9
图9
CDK1和2抑制剂阻碍RPTE细胞中BKPyV的复制。感染BKPyV（MOI）的RPTE细胞 属于 3） 受到CDK4/6抑制（1 μM PD0332991），CDK1/2抑制（20 μM Roscovitine）或CDK1抑制（5 μM RO-3306）。（A） qPCR测定每个细胞的病毒DNA拷贝数。从每个条件中提取DNA，测定BKPyV基因组拷贝数，将其归一化为宿主基因（TNF-α）拷贝数，并与未受抑制的对照组进行比较，其值任意设置为1(n个 = 6). （B） 通过Western blotting检测病毒蛋白VP1、VP2、VP3、agnoprotein（Agno）和LTAg的表达。Tubulin被用作负荷控制。（C） 在每个实验条件下产生的传染性BKPyV通过荧光焦点单元（FFU）分析测定，并归一化为未受抑制对照的值（任意设置为1）(n个 = 7). 误差线表示标准偏差*P（P） < 0.05; ***P（P） < 0.001; ****P（P） < 0.0001; ns，不显著（一个样本t吨测试实验条件与对照）。
图10
图10
LTAg存在下MDM2和p53水平相互作用的机制。（A） 未经处理的细胞。（B） 未感染、未转染的细胞被Nutlin-3抑制。（C） 在没有感染的情况下表达LTAg的细胞。（D） 感染BKPyV的细胞或表达LTAg的细胞合并细胞周期阻滞/DNA损伤。Ub，泛素。
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