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.2019年8月1日；317（2）:G127-G140。
doi:10.1152/ajpgi.00064.2019。 Epub 2019年5月29日。

乙醛抑制HBV-MHCⅠ类复合物在表达HBV的肝细胞上的显示

穆拉利·甘尼桑 1 2, 瓦杰斯拉夫·克鲁提克 1, 爱德华·马卡洛夫 三, 索米·马修斯 三, 库苏姆K哈尔班达 1 2, 拉里萨·波卢科托娃 三, 卡罗尔·凯西 1 2, 娜塔莉亚·奥斯纳 1 2
附属公司

乙醛抑制HBV-MHCⅠ类复合物在表达HBV的肝细胞上的显示

穆拉利·甘尼桑等。 美国生理学杂志胃肠测试肝脏生理学. .

摘要

乙型肝炎病毒（HBV）感染和酗酒是世界范围内的主要公共卫生问题，导致终末期肝病的发展。饮酒影响HBV感染的发病机制和治疗结果。HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在HBV清除中起着重要作用。以前的许多研究都集中于酒精诱导的免疫反应损伤。然而，目前尚不清楚酒精是否会改变感染肝细胞上HBV肽-主要组织相容性复合物（MHC）I类复合物的呈现，从而导致其无法被CTL识别。因此，本研究的重点是研究乙醇代谢影响HBV感染肝细胞CTL表位表达的机制。如本文所示，尽管细胞持续暴露于乙醛生成系统（AGS）会增加HepG2.2.15细胞中的HBV载量，但会降低细胞表面HBV核心肽18-27-人白细胞抗原A2复合物（CTL表位）的表达。此外，我们观察到AGS诱导蛋白酶体对肽加工所必需的糜蛋白酶和胰蛋白酶样蛋白酶体活性的抑制，以及IFNγ刺激的免疫蛋白酶体（IPR）功能和PA28激活物及免疫蛋白酶体亚单位LMP7和LMP2表达的下降。此外，干扰素γ诱导的肽载复合物（PLC）成分的激活，如与抗原处理相关的转运体（TAP1）和tapasin，被AGS抑制。IPR和PLC激活的减弱归因于AGS触发的HepG2.2.15细胞IFNγ信号的损伤。总的来说，所有这些下游事件都减少了HBV肽MHC I类复合物在肝细胞表面的显示，这可能抑制CTL的激活和免疫细胞对表达HBV的肝细胞上CTL表位的识别，从而导致肝脏炎症的持续。新的&值得注意的我们的研究表明，在表达HBV的HepG2.2.15细胞中，乙醛通过抑制糜蛋白酶和胰蛋白酶样蛋白酶体活性来改变HBV肽的加工过程，并降低IFNγ刺激的免疫蛋白酶体功能和PA28激活剂和免疫蛋白酶体亚基的表达。由于通过JAK-STAT1途径损伤IFNγ信号，它还抑制IFNγ诱导的肽载复合物（PLC）成分的激活。这些乙醛诱导的功能障碍减少了HBV肽MHC I类复合物在肝细胞表面的显示，从而导致HBV感染的持续性。

关键词：CTL；乙型肝炎病毒；干扰素γ；乙醛；蛋白酶体。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人未声明任何利益冲突，无论是财务还是其他方面。

数字

无
图形摘要
图1。
图1。
乙醛生成系统（AGS）对HepG2.2.15细胞的细胞毒性作用。在过去的24小时内，分别用AGS和干扰素-γ（IFNγ）处理或不处理细胞72小时和24小时。A类annexin V-FITC染色的流式细胞仪分析：以紫外线处理后收集的凋亡细胞作为阳性对照，其他4个处理细胞组与annexin-V-FITC孵育并进行流式细胞术分析。B和C类用裂解caspase-3抗体免疫印迹法进一步检测细胞凋亡；β-actin用于归一化。D类细胞毒性（坏死）通过乳酸脱氢酶（LDH）释放到细胞培养基中进行测定；使用Triton X-100处理的细胞培养基作为阳性对照（100%LDH泄漏）。细胞毒性百分比计算为（治疗组的LDH活性除以阳性对照组的LDH活性）。来自3个独立实验的数据显示为平均值 ± 用相同小写字母标记的横条彼此之间没有显著差异；不同小写字母的横条有显著差异(P（P）≤ 0 0.05).
图2。
图2。
乙醛生成系统（AGS）对HepG2.2.15细胞蛋白酶体活性的影响。在过去的24小时内，分别用AGS和干扰素-γ（IFNγ）处理或不处理细胞72小时和24小时。C类胸腺蛋白酶样（Cht-L；A类)类胰蛋白酶（T-L；B)和免疫蛋白酶体（IPR）-β5i-LMP7活性(C类)通过使用荧光底物Suc-LLVY-AMC、Boc-LRR-AMC和Ac-ANW-AMC的体外荧光分析在胞浆组分中检测到。D类和E类：在IFNγ诱导的ONX（100 nM，隔夜）处理的HepG2.2.15细胞中测量Cht-L和T-L活性。来自3个独立实验的数据显示为平均值 ± 用相同小写字母标记的横条彼此之间没有显著差异；不同小写字母的横条有显著差异(P（P）≤ 0 0.05).
图3。
图3。
乙醛生成系统（AGS）和乙型肝炎病毒（HBV）对蛋白酶体亚基蛋白表达的影响。在过去的24小时内，分别用AGS和干扰素-γ（IFNγ）处理或不处理细胞72小时和24小时。A类：通过免疫印迹法检测细胞裂解物中蛋白酶体激活剂PA28α和免疫蛋白酶体亚基低分子量聚肽（LMP）2和LMP7蛋白的表达。每条车道上装载了等量（20µg）的蛋白质；β-actin作为内部对照。B、 C类、和D类：来自3个独立实验的免疫印迹条带的定量作为手段 ± 用相同小写字母标记的横条彼此之间没有显著差异；不同小写字母的横条有显著差异(P（P）≤ 0 0.05).
图4。
图4。
乙醛生成系统（AGS）对干扰素-γ（IFNγ）诱导的免疫蛋白酶体（IPR）亚单位LMP2和LMP7蛋白表达的影响。细胞在72小时内是否用AGS处理，最后24小时用IFNγ处理。A类和B低分子量肽（LMP）2和LMP 7表达的免疫荧光染色。使用LSM 710共聚焦显微镜中的×63透镜观察染色。所示图片代表了3个具有类似结果的独立实验。
图5。
图5。
乙醛生成系统（AGS）对干扰素-γ（IFNγ）诱导的乙型肝炎病毒（HBV）核心C-延伸肽裂解的影响。用AGS或不用AGS处理细胞72小时，用IFNγ处理细胞最后24小时。将从细胞裂解物中提取的细胞溶胶蛋白（100μg/ml）与10 nM相应的C-延伸肽混合，如材料 和 方法。剩余（未分离）肽的百分比计算为完整肽峰与胞浆孵育后获得的积分单位除以从相同处理的未分离样品获得的积分单元×100。数据显示为在3个独立实验中重复的C-延伸肽裂解的代表性动力学，结果类似。
图6。
图6。
乙型肝炎病毒（HBV）核心肽18-27-人类白细胞抗原-A2（HLA-A2）识别HBV转染HepG2.2.15细胞的主要组织相容性复合物I（MHC）复合物的特异性。A类：HepG2细胞和HBV转染的HepG2.2.15细胞用于HBV核心肽（18-27）-HLA-A2 MHC复合物的免疫荧光染色。绿色显示HBV肽-HLA-A2 Alexa fluor 488染色。使用LSM 710共聚焦显微镜中的×63透镜观察染色。B：未经脉冲处理的HepG2细胞（不含HBV 18-27肽）和用5µM HBV 18-257肽脉冲处理4 h的HepG2细胞，然后用抗HBV肽-HLA-A2抗体的流式细胞术检测HBV核心肽（18-27）-HLA-A2-MHC复合物染色，然后暴露于Alexa fluor 647二级抗体。以Alexa fluor 647二抗为对照。数据收集在BD LSR2流式细胞仪上，并使用BD FACSDiva软件v.6.0进行分析。
图7。
图7。
乙醛生成系统（AGS）对乙型肝炎病毒（HBV）肽-人白细胞抗原-A2（HLA-A2）复合物在HepG2.2.15细胞表面表达的影响。A类：在干扰素-γ（IFNγ）存在下，用AGS处理HepG2.2.15细胞72小时，然后用抗HBV肽-HLA-A2抗体的流式细胞术检测HBV核心肽（18-27）FLPSDEFPSV-HLA-A1的表达，然后暴露于Alexa fluor 647次级抗体。使用小鼠IgG2b K同型对照。B：用流式细胞术测定IFNγ诱导的ONX（ONX 0914，100 nM，隔夜）处理的HepG2.2.15细胞中HBV核心肽（18–27）FLPSDEFPSV-HLA-A2的表达。在BD LSR2流式细胞仪上收集数据，并使用BD FACSDiva软件v.6.0进行分析。数据显示为3个具有类似结果的独立实验的代表性表达式。
图8。
图8。
乙醛生成系统（AGS）对干扰素-γ（IFNγ）诱导的与抗原处理1（TAP1）和tapasin相关的转运体表达的影响。HepG2.2.15细胞接受或不接受AGS治疗72小时，接受IFNγ治疗24小时。A类和C类：通过免疫印迹法检测细胞裂解物中TAP1和tapsin蛋白的表达。每条车道上装载了等量（20µg）的蛋白质；β-actin作为内部对照。B和D类：以平均值表示的3个独立实验的免疫印迹带定量 ± 用相同小写字母标记的横条彼此之间没有显著差异；小写字母不同的横条有显著差异(P（P）≤ 0 0.05).
图9。
图9。
乙醛生成系统（AGS）对干扰素-γ（IFNγ）诱导的表面主要组织相容性复合体I（MHCⅠ类）水平以及信号转导子和转录激活子1（STAT1）信号转导的影响。A类和B：HepG2.2.15细胞在IFNγ的存在下接受或不接受AGS治疗72小时。然后，通过低酸洗从细胞表面去除表面MHCⅠ类，然后使用抗人白细胞抗原-A2（HLA-A2）抗体通过流式细胞术检测人MHCⅠ级的恢复。使用小鼠IgG2b K同型对照品（别藻蓝蛋白，APC）。C类和D类：用AGS处理HepG2.2.15细胞72小时，用IFNγ处理最后1小时，并测量STAT1磷酸化（pSTAT1）。使用总STAT1对数据进行标准化，并使用β-actin作为内部控制。数据来自3个独立实验的平均值 ± 用相同小写字母标记的横条彼此之间没有显著差异；不同小写字母的横条有显著差异(P（P）≤ 0 0.05).
图10。
图10。
乙醛生成系统（AGS）对乙型肝炎病毒（HBV）RNA、HBV DNA、HBV表面抗原（HBsAg）和核心蛋白水平的影响。无论是否用AGS处理HepG2.2.15细胞72小时，用干扰素-γ（IFNγ）处理最后24小时。然后，收集细胞进行RNA和DNA分离。乙型肝炎病毒RNA(A类)和HBV DNA(B)分别用RT-PCR和ddPCR检测水平。采用GAPDH作为RT-PCR实验的内对照。C类：采用夹心ELISA法测定HBsAg水平。D类：HBV核心蛋白免疫染色（红色）和核染色（蓝色）的代表性图像。数据来自3个独立实验的平均值 ± 用相同小写字母标记的横条彼此之间没有显著差异；不同小写字母的横条有显著差异(P（P）≤0.05）。
图11。
图11。
乙醇代谢/乙醛（Ach）可能机制的模式影响肝细胞表面乙型肝炎病毒（HBV）-肽-主要组织相容性复合体I（MHC I类）[细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位]的呈现，而肝细胞是免疫反应的靶点。虽然Ach增加HBV复制，但它通过蛋白酶体直接抑制HBV肽的加工，并通过损害肝细胞中的干扰素-γ（IFNγ）信号，间接影响免疫蛋白酶体功能和肽负载复合物成分tapasin和与抗原处理1相关的转运体（TAP1）的诱导。最后，Ach抑制肝细胞表面HBV肽-MHC I类复合物的表达，这可能降低CTL的激活（通过CD8上T细胞受体的相互作用实现+肝细胞上具有HBV肽-MHC I类复合物的T淋巴细胞）和CTL识别HBV表达肝细胞作为靶点的能力。内质网。
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