The ionophore antibiotic gramicidin A inhibits pancreatic cancer stem cells associated with CD47 down-regulation

doi:10.1186/s12935-019-0862-6

.2019年5月22日19时145分。

doi:10.1186/s12935-019-0862-6。 2019年电子采集。

离子载体抗生素革兰菌素A抑制与CD47下调相关的胰腺癌干细胞

王瑞琪¹, 景耕¹, 魏锦生¹, 刘秀军¹, 闽江¹, 永苏镇¹

附属机构

采购管理信息： 31139022
PMCID公司： PMC6532126型
内政部： 10.1186/s12935-019-0862-6

离子载体抗生素革兰菌素A抑制与CD47下调相关的胰腺癌干细胞

王瑞琪等。癌细胞Int. 2019.

.2019年5月22日19时145分。

doi:10.1186/s12935-019-0862-6。 2019年电子采集。

作者

王瑞琪¹, 景耕¹, 魏金生¹, 刘秀军¹, 闽江¹, 永苏镇¹

附属

¹NHC抗生素生物技术重点实验室，肿瘤实验室，中国医学科学院药物生物技术研究所和北京协和医学院，中国北京天坛西丽1号，100050。

采购管理信息： 31139022
PMCID公司：下午6532126
内政部： 10.1186/s12935-019-0862-6

摘要

背景：胰腺癌干细胞（CSC）是一种特殊的细胞群体，具有无限的自我更新能力，对各种治疗都具有抵抗力。革兰菌素A（Gramicidin A，GrA）是一种来源于微生物的离子载体抗生素，可以在细胞膜上形成通道，破坏细胞离子稳态，导致细胞功能障碍和死亡。据报道，离子载体抗生素盐霉素（Sal）已被证明能有效杀死CSC。GrA是否具有作为CSC治疗药物的潜力尚不清楚。本研究探讨了GrA对胰腺CSC的影响及其机制。

方法：采用肿瘤球形成实验评估胰腺CSC的自我更新潜能。体外溶血试验检测GrA的临界浓度。采用CCK-8法检测胰腺癌细胞的增殖能力。流式细胞术检测细胞凋亡和线粒体膜电位。用扫描电镜和透射电镜分别观察细胞膜表面和线粒体的超微结构变化。Western blot分析用于确定相关蛋白表达水平。免疫荧光染色观察CD47再分布。

结果：0.05μM的GrA导致肿瘤球解体，胰腺癌BxPC-3和MIA-PaCa-2细胞数量减少。GrA和Sal均抑制癌细胞增殖。BxPC-3细胞的GrA和Sal的IC50值分别为0.025μM和0.363μM；而MIA PaCa-2细胞分别为0.032μM和0.163μM。在相同浓度下比较，GrA的疗效强于Sal。0.1μM或更低浓度的GrA不会引起溶血。GrA诱导细胞表面微绒毛样突起减少、线粒体肿胀等超微结构改变；此外，CD47在细胞表面重新分布。此外，GrA与吉西他滨在抑制癌细胞增殖方面表现出协同作用。

结论：研究发现，GrA对胰腺CSC具有高度活性。提示GrA对CD47下调相关的胰腺CSC具有抑制作用，提示GrA可能在调节巨噬细胞与肿瘤细胞的相互作用中发挥积极作用。

关键词：CD47；肿瘤干细胞；革兰菌素A；离子载体抗生素。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争性利益作者声明他们没有竞争性利益。

数字

图1
肿瘤球形成分析。一治疗前获得的BxPC-3和MIA PaCa-2细胞中肿瘤球的代表性图像（比例尺：100μm）。b用指示浓度的GrA治疗7天后获得的BxPC-3和MIA-PaCa-2肿瘤球的代表性图像（比例尺：50μm）。**c（c）**对用GrA或Sal治疗7天的BxPC-3和MIA-PaCa-2肿瘤球数量（对照组的百分比）进行统计分析，肿瘤球数量表示为平均值 ± 3口重复井的SD*P（P） < 0.05，**P < 0.01,^#P（P） < 0.05与对照组

图2
GrA体外溶血试验。一通过绘制血红素OD570与溶血百分比的关系，绘制校准图。b分别用浓度范围为0.00001–1μM的GrA、Sal和载体（DMSO）处理兔血样。检测OD570值，然后根据校准图转换为溶血百分比

图3
GrA和Sal对BxPC-3和MIA-PaCa-2细胞的体外细胞毒作用。一通过CCK-8分析，用适当浓度的GrA或Sal处理48 h培养的BxPC-3和MIA-PaCa-2细胞的存活率。每个浓度的数据来自3个重复的井。b流式细胞术检测BxPC-3和MIA-PaCa-2细胞凋亡。用0.1μM GrA或Sal处理细胞24小时。**c（c）**SEM图像显示经0.05μM GrA或Sal处理的BxPC-3和MIA PaCa-2细胞的表面形态变化，红色箭头表示细胞膜表面出现微绒毛样突起。比例尺：5μm（左），500 nm（右）

图4
GrA改变线粒体的超微结构和膜电位。一TEM图像显示了用0.05μM GrA或Sal处理24小时后BxPC-3和MIA-PaCa-2细胞的形态学变化。黄色箭头表示胰腺癌细胞中的线粒体。比例尺：500 nm。b流式细胞术检测0.01μM GrA或Sal对胰腺细胞线粒体膜电位的影响。X轴：绿色荧光强度，Y轴：红色荧光强度。**c（c）**分别用0.1和0.01μM的GrA和Sal处理BxPC-3和MIA-PaCa-2细胞48小时（上部）及其归一化密度分析（下部）后，VDAC的蛋白表达谱，*P < GrA与对照组0.05

图5
GrA对胰腺CSC标记物表达和分布的影响。一以图表形式表示了用0.1、0.01和0.001μM的GrA处理48小时后BxPC-3和MIA-PaCa-2细胞中CD133和CD44的蛋白表达谱。bwestern blot中CD44条带强度的密度测定定量。分别用GrA处理细胞24小时和48小时。**c（c）**免疫荧光染色显示CD47在0.05μM GrA作用24小时的BxPC-3细胞中的分布。d日免疫荧光染色显示CD47在0.05μM GrA作用24小时的MIA-PaCa-2细胞中的分布。细胞核经DAPI染色显示蓝色荧光，而细胞表面的CD47被绿色荧光抗体标记。白色箭头表示CD47簇

图6
GrA和GEM组合的影响。一图中显示了BxPC-3和MIA-PaCa-2细胞的GrA和GEM的CDI值。通过CCK-8分析测定用适当浓度的GrA、GEM或其组合处理48 h的培养MIA-PaCa-2细胞的活性。每个浓度的数据来自3个重复的井。b分别用0.05μM GrA、0.05μM GEM或其组合处理3 h、6 h和24 h后，对MIA-PaCa-2细胞的蛋白质进行Western blot分析。**c（c）**24小时处理蛋白带密度定量b.d日蛋白质印迹实验中VDAC带强度的密度测定定量。蛋白质样本取自经0.05μM、0.005μM GrA、GEM或其组合处理的MIA-PaCa-2细胞*P（P） < 0.05英寸GrA + GEM 0.05μM vs对照组和GrA + 创业板0.05μM vs创业板0.05微米。**e（电子）**0.1和0.01μM GrA处理的RAW264.7细胞和THP-1细胞SIRPα和CD68的Western blot分析

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