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.2019年5月28日;10(3):e00420-19。
doi:10.1128/mBio.00420-19。

EPCR和ICAM-1介导恶性疟原虫与构建的3D脑微血管的结合异质性

附属公司

EPCR和ICAM-1介导恶性疟原虫与构建的3D脑微血管的结合异质性

玛丽亚·伯纳乌等。 mBio公司. .

摘要

脑疟疾是一种严重的神经系统并发症,与恶性疟原虫-脑微血管中受感染的红细胞(IE),但其特异性结合相互作用仍存在争议。在这里,我们建立了一个工程化的三维(3D)人脑内皮微血管模型,并对其进行了研究恶性疟原虫在健康和疾病中发生的大范围生理流速下结合。对3D微血管的灌注分析揭示了与肿瘤坏死因子α(TNF-α)激活的脑内皮细胞结合的寄生虫先前未被发现的表型异质性。而表达B组的克隆寄生虫系恶性疟原虫红细胞膜蛋白1(PfEMP1)与活化的3D微血管的结合增加,恶性疟原虫-IE表达的DC8-PfEMP1表现出结合减少。内皮细胞活化的差异反应由内皮蛋白C受体(EPCR)和细胞间粘附分子1(ICAM-1)的表面表达变化介导。这些发现证明了寄生虫结合的异质性,并为寄生虫在感染期间适应变化的微血管环境提供了证据。工程化3D人脑微血管模型为疟原虫结合提供了新的机制,并为疟疾发病机制和疟原虫与血管相互作用的进一步研究提供了机会。重要性脑疟疾的研究因无法获得大脑而受到阻碍。在这里,我们开发了一个工程化的3D人脑微血管模型,该模型模拟小血管的血流速度和结构,以研究如何恶性疟原虫-受感染的人红细胞附着在脑内皮细胞上。通过研究具有不同粘附特性的疟原虫株系,我们表明疟原虫结合率是异质的,受血流生理差异以及内皮细胞是否先前被TNF-α(一种与疟疾严重程度相关的促炎细胞因子)激活的强烈影响。我们还显示了人类EPCR和ICAM-1在寄生虫结合中的重要性。我们的模型揭示了如何恶性疟原虫结合在脑微血管内,为未来研究人类脑病原体向脑血管内壁募集提供了一种强有力的方法。

关键词:PfEMP1;恶性疟原虫;脑疟疾;微血管;组织工程。

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数字

图1
图1
3D脑微血管的特征。(A) (左)带一角硬币(直径17.9)的组装三维微血管装置照片毫米)。(右)用食物染料灌注的3D微血管。(B) 三维微血管的横截面示意图。(C) 免疫荧光分析(IFA)z投影三维脑微血管共焦切片(左)和横切面(右),标记有抗VE-卡德林(红色)和DAPI(蓝色)。(D) 平面中流速(z = 50μm)和估计WSS(z = 0μm)网格几何中的分布,在HBMEC胶原重塑之前用COMSOL模拟(见材料和方法)。嵌入式横截面图表示入口后第一个分支的管腔。(E) 栅格部分的三维重建。颜色表示抗VE-cadherin抗体(红色)、抗VWF抗体(绿色)和DAPI(蓝色)。星号,管腔。(F) 透射电子显微镜(TEM)显示内皮连接和局部接触。EC1和EC2,内皮细胞1和2;星号,电子密度接触。(G) TEM显示Weibel-Palade体(箭头,顶部)和VWF的IFA z投影(绿色,底部)。(H) 极化小窝的TEM图像(箭头,顶部)和小窝蛋白-1的IFA z投影(洋红,底部)。(一) TEM图像显示HBMEC的线粒体(M)含量较高。(J) 用抗β-连环蛋白抗体染色的粘附连接的IFA z投影(绿色)。面板G、H和J的细胞核用DAPI染色(蓝色)。
图2
图2
恶性疟原虫IE在3D脑微血管中的WSS依赖性结合。(A) IE的卡通示意图表示IT4var19绑定到EPCR。(B) IT4var19和对照无节2G2线在3D微血管中不同估计WSS区域的结合。中位数由点表示,四分位范围由彩色区域表示。箱状区域(虚线)的统计分析通过Mann-Whitney检验确定(n个 = 4个独立的生物复制品)(研究设计见图S3和材料与方法)。(C) 静态结合分析中IT4var19与静止HBMEC单层的结合(n个 = 9个生物复制品)。在方框图中,水平线表示中位数,胡须表示第10和第90个百分位。(D) 经DAPI染色的IT4var19与HBMEC单层(左)和3D微血管(右)结合的代表性图像。(E) 时间推移的图像显示,随着时间的推移,一群隔离的寄生虫在生长。面板D和E中的闭锁寄生虫以黄色虚线轮廓突出显示。(F) IE细胞粘附HBMEC(EC)的典型TEM图像。旋钮用箭头表示。
图3
图3
PfEMP1在3D微血管中呈现异质性结合。(A) 恶性疟原虫寄生虫系的卡通示意图,它们各自的PfEMP1,以及与内皮受体的结合特性。(B) 静态结合分析中IT4var19、HB3var03和ITGICAM-1 IE与休眠HBMEC单层的结合。在方框图中,水平线表示中位数,胡须表示第10和第90个百分位。统计显著性由Kruskal-Wallis检验确定,该检验经Benjamini、Krieger和Yekutieli方法的多重比较修正(n个 = 5至9个生物重复)。(C) 3D微血管中不同WSS区域的IT4var19、HB3var03和ITGICAM-1 IE结合水平。中位数由点表示,四分位范围由彩色区域表示。箱线图(i,1.9至2.5)显示了箱线区域(虚线)的统计分析达因/厘米2; ii,1至1.5达因/厘米2; iii,0.15至0.3达因/厘米2)并通过Kruskal-Wallis检验确定,该检验经Benjamini、Krieger和Yekutieli方法的多重比较修正(n个 = 4到5个独立的生物复制)。水平线表示中位数,胡须表示第10个和第90个百分位,点表示最小值和最大值。ns,不显著。
图4
图4
恶性疟原虫与静息状态和TNF-α刺激的3D脑微血管结合。(A) 静息和激活条件下原发性HBMEC受体表面表达的示意图。(B) 用流式细胞术测定静止HBMEC单层和18天后的表面受体表达用TNF-α刺激h。条形图表示平均值±标准偏差(SD)(n个 = 3个生物复制品)。统计分析由未配对的测试。MFI(AU),平均荧光强度(任意单位)。(C) 用抗ICAM-1抗体(品红)染色的静息和激活的3D脑微血管的IFA z投影。(D到F)IE与休息和TNF-α激活的结合水平(18h) 3D微血管。点表示中间绑定级别,彩色区域表示四分位范围(n个 = 4至5个独立的生物重复)。采用Mann-Whitney检验对装箱区域进行统计分析。
图5
图5
EPCR和ICAM-1在恶性疟原虫-IE与3D脑微血管结合中的作用。(A至C)存在抗EPCR MAb 252或抗ICAM-1 MAb 15.2抗体时恶性疟原虫-IE的结合百分比。结合百分比标准化为存在IgG对照抗体或不进行抗体治疗时的结合。条形图表示平均值±平均值标准误差(SEM)(n个 = 4到5个独立的生物复制)。两两比较中箱区的统计分析通过Mann-Whitney检验确定,多重比较中的箱区统计分析通过Kruskal-Wallis检验进行校正。
图6
图6
脑疟疾分离物在3D脑微血管中的结合。(A) 用一种寄生虫分离物(3173-S)灌注3D微血管,该寄生虫分离物是通过有限稀释从视网膜病变阳性的脑疟疾患者中克隆出来的。(B) N末端DBLα标记的序列分析表明无功功率,无功功率基因占扩增总量的90%无功功率,无功功率抄本。(C) 定量实时PCR(qRT-PCR)分析无功功率,无功功率结构域引物和显性DBLα标签序列延伸到侧翼结构域(图S6)表明3173-S变量1该转录本呈现了一种预计与EPCR结合的类似DC8的结构。(D) 3173-S的装订(n个 = 5到6个独立的生物复制)到休息和TNF-α激活(18h) 3D微血管。点表示中间绑定级别,彩色区域表示四分位范围。(E) 在没有或存在抗EPCR MAb 252抑制抗体的情况下3173-S的结合百分比。在不进行治疗的情况下,结合百分比标准化为结合水平。条形代表平均值±SEM(n个 = 5到6个独立的生物复制)。面板D和E中箱状区域的统计分析通过Mann-Whitney检验确定。
图7
图7
恶性疟原虫与静止和激活的3D脑微血管呈异质性结合。具有不同细胞粘附表型的寄生虫在不同感染阶段结合的假设模型:无症状/早期感染(静息内皮)和晚期感染疾病(激活内皮)。总的来说,除了ITGICAM-1在WSS>1时的结合水平较高外,这三个寄生虫系在静息内皮细胞上表现出相似的结合水平达因/厘米2相反,随着内皮细胞的激活,寄生虫线会发生分化。IT4var19和3173-S(DC8-EPCR结合物)与活化内皮的结合减少,ITGICAM-1(双CD36和高ICAM-1亲和力)与活化的内皮的结合增加,HB3var03(双EPCR和低ICAM-1亲力)在两种状态下的结合水平相似。下面的示意图说明了具有不同组合结合特性的PfEMP1变异体如何为寄生虫提供复杂的策略,以快速适应伴随内皮激活的EPCR和ICAM-1表达水平的变化。

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