The human brain somatostatin interactome: SST binds selectively to P-type family ATPases

doi:10.1371/journal.pone.0217392

.2019年5月28日；14（5）：e0217392。

doi:10.1371/journal.pone.0217392。 2019年eCollection。

人脑生长抑素相互作用组：SST选择性结合P型家族ATP酶

迈克尔·索拉斯基¹, 德克兰·威廉姆斯¹, Mohadesh Mehrabian公司¹, 王汉森（Hansen Wang）¹, 霍尔格·威利^2 三, 杰罗德·施密特（Gerold Schmitt-Ulms）^1 4

附属公司

¹加拿大安大略省多伦多市克伦贝尔发现中心多伦多大学坦兹神经退行性疾病研究中心。
²加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学生物化学系。
^三加拿大艾伯塔省埃德蒙顿市艾伯塔大学朊病毒和蛋白质折叠疾病中心。
⁴加拿大安大略省多伦多市多伦多大学实验医学与病理生物学系。

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人脑生长抑素相互作用组：SST选择性结合P型家族ATP酶

迈克尔·索拉斯基等。公共科学图书馆一号. 2019.

.2019年5月28日；14（5）：e0217392。

doi:10.1371/journal.pone.0217392。 2019年eCollection。

作者

迈克尔·索拉斯基¹, 德克兰·威廉姆斯¹, Mohadesh Mehrabian公司¹, 王汉森（Hansen Wang）¹, 霍尔格·威利^2 三, 杰罗德·施密特（Gerold Schmitt-Ulms）^1 4

附属公司

¹加拿大安大略省多伦多市克伦贝尔发现中心多伦多大学坦兹神经退行性疾病研究中心。
²加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学生物化学系。
^三加拿大艾伯塔省埃德蒙顿市艾伯塔大学朊病毒和蛋白质折叠疾病中心。
⁴加拿大安大略省多伦多市多伦多大学实验医学与病理生物学系。

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摘要

生长抑素（SST）是一种环状肽，通过与五种典型的G蛋白偶联SST受体（SSTR1至SSTR5）之一结合，可以抑制多种细胞释放激素和神经递质。最近，还观察到SST与淀粉样蛋白β（Aβ）肽相互作用，并影响其聚集动力学，增加了其与其他脑蛋白结合的可能性。在此，我们报告了一项SST相互作用组分析，该分析利用人脑提取物作为生物源材料，并结合先进的质谱工作流程来相对定量SST结合蛋白。分析显示SST主要结合ATP酶P型家族的几个成员。随后的验证实验证实了SST和钠钾泵（Na+/K+-ATPase）之间的相互作用，并确定SST内的色氨酸残基对结合至关重要。对三种不同细胞系的功能分析表明，SST可能对Na+/K+-ATP酶的K+摄取速率产生负调节。

PubMed免责声明

利益冲突声明

HaW和GS于2017年持有淀粉样β结合多肽的临时专利（申请号62/451309）。此时，临时专利到期，没有申请常规专利。其他作者声明，不存在相互竞争的利益。这不会改变我们对PLOS ONE数据和材料共享政策的遵守。

数字

**图1。SST相互作用组实验设计。**
（A）亲和捕获实验中使用的诱饵肽示意图。（B） SST相互作用组分析的工作流程，旨在比较N-末端生物素化-SST28（x）和SST14（y）与截短突变肽SST14Δ7–10（z）的结合物。

**图2。SST基准相互作用分析和初步数据。**
（A）交互组数据集中PSM的数量与错误发现率（FDR）。（B）丙酰辅酶A羧化酶的相对定量，在所有样品中显示出类似的富集水平，以及钠⁺/K（K）⁺-转运ATP酶亚单位α-1，该亚单位在生物素SST28亲和捕获洗脱液中高度富集。方框图描述了用于log2空间定量的单个丙酰基辅酶A羧化酶肽的富集比（R），以及中位肽比和四分位数范围（IQR）。由于冗余或未能通过严格阈值，定量中消除了肽子集（红圈）。相对蛋白质水平以比率表示，与最重等压标签相对应的离子强度作为参考。（C）短名单中生物素SST28亲和捕获洗脱液富集度最高的蛋白质的“细胞成分”和“分子功能”基因本体分析。

**图3。ATP1A1作为SST28/14的候选相互作用因子的鉴定。**
（A）为验证SST-Na而进行的竞争性结合实验的工作流程⁺/K（K）⁺-转运ATP酶亚基α-1相互作用。（B）免疫印迹和银染显示SST28亲和捕获洗脱液的SDS-PAGE分析。针对ATP1A1的免疫印迹显示，ATP1A1与生物素SST28的结合可通过将脑裂解物与游离SST14（50μM；通道4）预先孵育而被阻断。当用银染法分析相同的样品时，对应于ATP1A1的洗脱液中没有显著的条带（第7、8道）。请注意，SST28亲和捕获洗脱液中缺失的输入和未结合部分（通道5、6）中存在强条带，这表明SST不倾向于仅根据其丰度与其他蛋白质相互作用。洗脱液样品中约50、14和4 kDa的条带可能对应于链霉亲和素亚基和生物素SST28肽，这些肽在洗脱步骤中从亲和捕获树脂中滤出，因为它们在输入组分和未结合组分中不存在。

**图4。SST与Na结合的验证⁺/K（K）⁺-ATP酶α和β亚单位。**
（A）竞争性结合实验的免疫印迹分析SST14和突变肽SST14-W8P（左）及其定量western blot数据（右）。通过捕获ATP1A1和ATP1B1生物素SST28可以通过脑裂解物的预孵育来阻断带免费SST14（50μM；车道5-7），但不带氨基酸替换（W8P）的突变SST14接收器绑定位置（50μM；通道8–10）。请注意阴性对照诱饵肽，生物素SST14Δ7–10，未能捕获任何可检测到的ATP1A1（11–13车道）。同一斑点的考马斯染色证实使用链霉亲和素亚单位在每个孔中装载蛋白质作为加载控件从关联矩阵中释放（下部面板）。美国国立卫生研究院（NIH）图像J密度测定分析了出现在98 kDa和49 kDa分子量标记附近的抗ATP1A1-和抗ATP1B1-活性条带，如右图所示（B）生物素SST28对ATP1A1的捕获可以通过用游离SST28（50μM；通道6）预孵育脑裂解物来阻止或SST14（50μM；车道7），但不适用于SST14-W8P（50μM；车道8）。尽管含有受体结合序列，截短型SST14也无法阻止ATP1A1的捕获（50μM；9、10道）(FWKT公司). 考马斯染色证实整个凝胶（中间面板）的蛋白质负载是一致的。NIH ImageJ下面板显示了出现的抗ATP1A1活性条带的密度测定（C）生物素SST-28对ATP1A1的捕获可以通过预先孵育含有游离SST28（25μM或50μM；3、5道）的脑裂解物来阻断，但与western blot（上面板）所示的类似神经肽VIP（25μM或50μM；4、6道）不同和抗ATP1A1反应带的密度测定（下面板）。

**图5。SST14调节⁸⁶卢比⁺钠的吸收⁺/K（K）⁺-ReN、N2a和HEK293细胞中的ATP酶。**
向ReN、N2a和HEK293细胞中添加SST14（50μM）可减少对⁸⁶卢比⁺与对照组相比，分别为91.5%、53.6%和74.4%。用哇巴因（2 mM）治疗后⁸⁶卢比⁺ReN细胞、N2a细胞和HEK293细胞分别减少至50.7%、8.9%和54.3%。注意，将SST14添加到哇巴因处理的细胞中不会进一步减少⁸⁶卢比⁺与单独用哇巴因处理的细胞相比。

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1. Brazeau P、Vale W、Burgus R、Ling N、Butcher M、Rivier J等。抑制免疫反应性垂体生长激素分泌的下丘脑多肽。科学。1973;179（4068）：77–9。-公共医学
1. Strowski MZ，Blake AD。内分泌胰腺生长抑素受体的功能和表达。分子细胞内分泌。2008;286（1-2）：169–79 10.1016/j.mce.2008.02.007-内政部-公共医学
1. Piqueras L，Martinez V.生长抑素受体在野生型和生长抑素2型敲除小鼠胃酸分泌中的作用。Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol公司。2004;370（6）：510–20 10.1007/s00210-004-0992-8-内政部-公共医学
1. Shen LP、Pictet RL、Rutter WJ。人生长抑素I：cDNA序列。美国国家科学院院刊1982；79(15):4575–9. 10.1073页/第79页，第545575页-内政部-项目管理委员会-公共医学
1. Samson WK、Zhang JV、Avsian-Kretchmer O、Cui K、Yosten GL、Klein C等。生长抑素基因编码的神经诺他丁调节神经元、心血管和代谢功能。生物化学杂志。2008;283（46）：31949–59 10.1074/jbc。M804784200型-内政部-项目管理委员会-公共医学

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HoW和GS从阿尔伯塔朊病毒研究所获得资金（拨款编号：201600028）。我们感谢罗西亚克家族最慷慨的慈善支持。这项研究的质谱部分是通过欧文家族的一次重大捐赠实现的。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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[1] Brazeau P、Vale W、Burgus R、Ling N、Butcher M、Rivier J等。抑制免疫反应性垂体生长激素分泌的下丘脑多肽。科学。1973;179（4068）：77–9。-公共医学

[2] Brazeau P、Vale W、Burgus R、Ling N、Butcher M、Rivier J等。抑制免疫反应性垂体生长激素分泌的下丘脑多肽。科学。1973;179（4068）：77–9。-公共医学

[3] Strowski MZ，Blake AD。内分泌胰腺生长抑素受体的功能和表达。分子细胞内分泌。2008;286（1-2）：169–79 10.1016/j.mce.2008.02.007-内政部-公共医学

[4] Strowski MZ，Blake AD。内分泌胰腺生长抑素受体的功能和表达。分子细胞内分泌。2008;286（1-2）：169–79 10.1016/j.mce.2008.02.007-内政部-公共医学

[5] Piqueras L，Martinez V.生长抑素受体在野生型和生长抑素2型敲除小鼠胃酸分泌中的作用。Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol公司。2004;370（6）：510–20 10.1007/s00210-004-0992-8-内政部-公共医学

[6] Piqueras L，Martinez V.生长抑素受体在野生型和生长抑素2型敲除小鼠胃酸分泌中的作用。Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol公司。2004;370（6）：510–20 10.1007/s00210-004-0992-8-内政部-公共医学

[7] Shen LP、Pictet RL、Rutter WJ。人生长抑素I：cDNA序列。美国国家科学院院刊1982；79(15):4575–9. 10.1073页/第79页，第545575页-内政部-项目管理委员会-公共医学

[8] Shen LP、Pictet RL、Rutter WJ。人生长抑素I：cDNA序列。美国国家科学院院刊1982；79(15):4575–9. 10.1073页/第79页，第545575页-内政部-项目管理委员会-公共医学

[9] Samson WK、Zhang JV、Avsian-Kretchmer O、Cui K、Yosten GL、Klein C等。生长抑素基因编码的神经诺他丁调节神经元、心血管和代谢功能。生物化学杂志。2008;283（46）：31949–59 10.1074/jbc。M804784200型-内政部-项目管理委员会-公共医学

[10] Samson WK、Zhang JV、Avsian-Kretchmer O、Cui K、Yosten GL、Klein C等。生长抑素基因编码的神经诺他丁调节神经元、心血管和代谢功能。生物化学杂志。2008;283（46）：31949–59 10.1074/jbc。M804784200型-内政部-项目管理委员会-公共医学

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