HspB1 phosphorylation regulates its intramolecular dynamics and mechanosensitive molecular chaperone interaction with filamin C

doi:10.1126/sciadv.aav8421

.2019年5月22日；5（5）：eaav8421。

doi:10.1126/sciadv.aav8421。 eCollection 2019年5月。

HspB1磷酸化调节其分子内动力学和与丝氨酸C的机械敏感性分子伴侣相互作用

附属公司

¹英国牛津OX1 3QZ南帕克斯路牛津大学化学系，物理和理论化学实验室。
²英国牛津大学牛津大学拉德克利夫医学部和英国心脏基金会卓越研究中心心血管医学部，牛津大学，Headington，OX3 9DU。
³新西兰克赖斯特彻奇8140坎特伯雷大学生物分子相互作用中心和物理化学学院。
⁴英国达勒姆DH1 3LE南路达勒姆大学化学系。
⁵奥地利维也纳A-1030维也纳生物中心5号维也纳大学Max F.Perutz实验室结构与计算生物学系。
⁶波恩大学细胞生物学研究所分子细胞生物学系，德国波恩D53121。
⁷卢布尔雅那大学化学与化学技术学院生物化学系，斯洛文尼亚卢布尔雅那1000号Večna pot 113。
⁸伯明翰大学心血管科学研究所，英国伯明翰B15 2TT。

PMID： 31131323
预防性维修识别码： PMC6530996型
内政部： 10.1126/sciadv.aav8421

HspB1磷酸化调节其分子内动力学和与丝氨酸C的机械敏感性分子伴侣相互作用

米兰达·P·科利尔等。科技进步. 2019.

.2019年5月22日；5（5）：eaav8421。

doi:10.1126/sciadv.aav8421。 eCollection 2019年5月。

附属公司

¹英国牛津OX1 3QZ南帕克斯路牛津大学化学系，物理和理论化学实验室。
²英国牛津大学牛津大学拉德克利夫医学部和英国心脏基金会卓越研究中心心血管医学部，牛津大学，Headington，OX3 9DU。
³新西兰克赖斯特彻奇8140坎特伯雷大学生物分子相互作用中心和物理化学学院。
⁴英国达勒姆DH1 3LE南路达勒姆大学化学系。
⁵奥地利维也纳A-1030维也纳生物中心5号维也纳大学Max F.Perutz实验室结构与计算生物学系。
⁶波恩大学细胞生物学研究所分子细胞生物学系，德国波恩D53121。
⁷卢布尔雅那大学化学与化学技术学院生物化学系，斯洛文尼亚卢布尔雅那1000号Večna pot 113。
⁸伯明翰大学心血管科学研究所，英国伯明翰B15 2TT。

PMID： 31131323
预防性维修识别码： PMC6530996型
内政部： 10.1126/sciadv.aav8421

摘要

机械力诱导的蛋白质构象变化是多种生理功能的基础，以肌肉收缩机制为典型。肌动蛋白结合蛋白丝蛋白C（FLNC）的突变与以生物力学特性改变为特征的肌肉骨骼病理学有关，有时还与聚集性有关。HspB1是一种丰富的分子伴侣蛋白，普遍存在于横纹肌中，在横纹肌对包括机械应激在内的信号进行磷酸化反应。我们报道了这两种蛋白在三种生物力学应激小鼠模型中的相互作用和上调，其中HspB1被磷酸化，FLNC定位于承重部位。我们展示了磷酸化如何导致HspB1磷灰石周围残基的暴露增加，从而促进其与FLNC的致密多域区域的结合，该区域被认为具有机械传感功能。FLNC的定向去折叠显示其延伸轨迹受HspB1磷酸化区域的调控。这可能代表了一种翻译后调节的伴侣-客户端保护机制，其目标是在机械应力期间过度伸展。

PubMed免责声明

数字

**图1。FLNC和HspB1在MLP-KO小鼠心脏中上调，并以磷酸化依赖的方式通过结构域18至21相互作用。**
(A类)Z椎间盘和夹层椎间盘横纹肌FLNC组成和定位示意图。灰线、多个Z盘蛋白，包括α-肌动蛋白、结蛋白等。适配器：塔利班、管状蛋白、连环蛋白等。PM、质膜。ABD，FLNC的肌动蛋白结合域。图中未示：可能在服装店进行本地化。(B类)WT和MLP KO小鼠心室组织的冷冻切片。切片进行FLNC染色，并进行复染，以显示肌节（肌凝蛋白）和间盘（N-钙粘蛋白）。比例尺，10μm。FLNC主要定位于夹层椎间盘和肉质Z椎间盘（分别为蓝色和红色条纹箭头），在DCM组织中更为丰富。(C类)使用FLNC特异性抗体或同型对照和裂解物对照，从MLP KO心室组织裂解物中获得免疫沉淀（IP）。标记位置的分子质量。星号表示来自抗体链的信号。HspB1与FLNC共沉淀，证明内源性蛋白质之间存在相互作用。(D类)来自WT和MLP-KO小鼠心脏匀浆的FLNC、HspB1、HspB2和HspB2的蛋白质印迹，^P（P）HspB1和GAPDH（甘油醛磷酸脱氢酶）作为负荷控制。MLP-KO心脏中FLNC和HspB1均上调，HspB1在Ser⁸⁶（相当于人类Ser⁸²). (E类)重组EEF标记FLNC_{第18–21天}与T7标记的HspB1混合并免疫沉淀。T7抗体（但不是同型对照）同时降低了HspB1和FLNC_{第18–21天}，表明重组蛋白之间的结合。当样品中省略T7-HspB1时，两种蛋白质均未被去除。(F类)重组FLNC混合物的颗粒部分_{第18–21天}和WT或^3P公司HspB1在25°C下90分钟孵育过程中。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）密度测定法。

**图2。热休克蛋白B1_77–171发生动力学变化，导致磷拟态发生部分解离。**
(A类)覆盖¹H（H）-¹⁵HspB1的N异核单量子相干谱_84–171（灰色），HspB1_77–171（粉红色），和^2相热休克蛋白B1_77–171（栗色）。磷模拟后，7.8至8.6 ppm区域出现更多信号。(B类)N-H阶参数(*S公司*²)使用指定的主干化学位移从^2相热休克蛋白B1_77–171（褐红色）和来自HspB1的MD模拟_84–171（灰色）确认PPR和β2链高度动态（顶部）。一个情节*R（右）*_前任，一个由探测的微秒-毫秒运动的定性度量¹⁵N CPMG弛豫色散，用于HspB1_84–171（灰色）和^2相热休克蛋白B1_77–171（栗色）揭示了残基95至110（底部）中动力学的显著增加。显示了PDB 4MJH的二级结构元件。*R（右）*_前任数据为平均值±标准偏差(C类)HspB1的1μs MD模拟快照_84–171显示aβ2链完全解离。残留物根据*R（右）*_前任【来自（B）】，显示动态增强区域位于ACD侧的β3-β4环中。(D类和E类)HspB1的本征质谱和化学计量定量_77–171WT（粉红色），1P(^P（P）序号⁸²、黄色）和2P(^P（P）序号⁷⁸-^P（P）序号⁸²，栗色）。该结构填充单体-二聚体平衡，磷酸拟态将低聚物状态转移到单体。数据为平均值±SD。

**图3。HspB1 ACD的晶体结构与PPR的部分肽模拟物复合。**
(A类)具有肽PPR模拟结合的HspB1 ACD二聚体。虚线表示反平行时间间隔接口。(B类)（A）中黑色箭头所示的区域，表示β2链的两个位置：与β3结合（左侧）或与ACD分离，并穿过相邻单体的β4-β8凹槽（右侧）。(C类)PPR结合[（A）中的红色箭头]，显示为不对称单元中四种肽结合单体的重叠。尽管ACDs紧密重叠，但肽表现出异质性和灵活性。旋转视图显示β2链的分歧，有时向肽结合位点呈弧形，在一个实例中部分模拟为肽的延续。

**图4。^（P）热休克蛋白B1_80–88和FLNC_{第18–21天}形成以磷酸化依赖方式延伸的复合物。**
(A类)HspB1区域80至88的位置，FLNC_{第18–21天}在随后的IM-MS实验中用作肽的结合表位显示在HspB1的每个亚单位上_84–170二聚体结构。(B类)FLNC天然质谱的等高线图_{第18–21天}通过滴定未磷酸化（顶部）和磷酸化（中间）肽获得。根据质谱中出现的新峰，观察到多个肽的结合，在图中显示为额外的水平条纹。粉线表示肽结合FLNC；线厚度表示电荷系列，因此具有相同的化学计量比。使用标准方法拟合结合曲线并假设有多达三个等效结合位点，显示每个肽与FLNC的亲和力相似_{第18–21天}（底部）。数据为平均值±SEM(C类)多肽的解离受气相活化的影响，磷酸化多肽仍与比未磷酸化等效物更高的电位结合。击穿曲线（源自串联质谱数据，见图S5）显示了肽之间的明显差异，显示为连续的单次实验，误差条表示重复计算的一个SD。（B）中虚线下方的质谱投影到右侧。在40 V时，结合差异可以忽略不计，但在140 V时，所有未磷酸化的肽都被排出，而磷酸化肽没有被排出。(D类)FLNC 13+充电阶段的库仑引导展开_{第18–21天}未绑定，绑定到一个HspB1_80–88，并绑定到一个^P（P）热休克蛋白B1_80–88在30和90 V下的底部重叠到达时间分布，突出了结合磷肽（*）的中间状态的持久性。展开图上的行指定将一半中间物转换为最终状态所需的激活。(E类)力诱导的FLNC变化示意图揭示了展开图以及与HspB1肽结合的关系。右侧面板将机械应力和全长蛋白质联系起来。

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1. Willis M.S.，Patterson C.，蛋白质毒性和心脏功能障碍——心脏阿尔茨海默病？北英格兰。《医学杂志》368、455–464（2013）。-公共医学
1. Ferrer I.，OlivéM.，肌原纤维肌病的分子病理学。《分子医学专家评论》10，e25（2008）。-公共医学
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