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.2019年7月；20（1）：81-94。
doi:10.3892/mmr.2019.10222。 Epub 2019年5月9日。

miRNA‑30a‑3p通过靶向胰岛素样生长因子1受体抑制食管癌转移并增强放射敏感性

范燕欣 1, 卞秀华 1, 浦东钱庄 1, 景文 1, 彭伟燕 1, 罗艳红 1, 吴晶（音译） 1, 钱章 1
附属公司

miRNA‑30a‑3p通过靶向胰岛素样生长因子1受体抑制食管癌转移并增强放射敏感性

燕鑫范等。 摩尔医学代表. 2019年7月.

摘要

已经证明，microRNAs（miRNAs）在各种生物过程中发挥着重要作用，例如肿瘤发生。在本研究中，研究了miR‑30a‑3p在食管癌（EC）发病机制中的作用。采用逆转录定量聚合酶链反应测定EC组织和细胞系中miR‑30a‑3p的表达水平。然后，分别采用划痕法、Transwell法和放射敏感性试验研究miR‑30a‑3p对EC细胞迁移、侵袭和放射敏感性的影响。进行了双荧光素酶报告子分析，以确定miR‑30a‑3p与胰岛素样生长因子1受体（IGF‑1R）的3'‑非翻译区（3'‑的UTR）之间的潜在相互作用。结果表明，与配对健康组织和人类食管上皮细胞系相比，EC组织和细胞系中miR‑30a‑3p的表达水平显著降低。上调miR‑30a‑3p表达显著抑制EC细胞的迁移、侵袭和上皮-间充质转化（EMT），并增强其放射敏感性。荧光素酶活性分析表明，miR‑30a‑3p与IGF‑1R的3'‑UTR相互作用，并且IGF-1R的敲除对EC细胞的迁移、侵袭、EMT和放射敏感性产生类似的影响。结果表明，miR‑30a‑3p通过下调IGF‑1R抑制EC细胞的转移，增强EC细胞的放射敏感性，提示miR鄄30a鄄3p可能是治疗EC的潜在靶点。

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数字

图1。
图1。
miR-30a-3p在EC组织和细胞系中下调。（A） RT-qPCR检测miR-30a-3p在EC组织和配对正常组织中的表达。（B） 通过RT-qPCR测定EC细胞系（EC9706和EC109）和人食管上皮细胞系（HET-1A）中miR-30a-3p的表达。（C） 在EC9706和EC109细胞中转染miR-30a-3p模拟物或miR-30a-3p抑制剂后，通过RT-qPCR评估转染效率。数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差，每个实验一式三份**与HET-1A或对照组相比，P<0.01。##与NC组相比，P<0.01。食管癌；miR，microRNA；NC，阴性对照；RT-qPCR，逆转录定量聚合酶链反应。
图2。
图2。
miR-30a-3p抑制EC9706细胞的迁移和侵袭。用（A）划痕法和（B）Transwell法研究转染miR-30a-3p模拟物或miR-30a-3p抑制剂48 h的EC9706细胞的迁移能力。（C） 通过Transwell侵袭试验评估转染EC9706细胞的侵袭能力。在放大×200倍的倒置显微镜下对每个孔中的细胞进行计数。（D） western blot分析MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平。数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差；每个实验一式三份进行**与对照组相比，P<0.01。#P<0.05，##与NC组相比，P<0.01。miR，microRNA；基质金属蛋白酶；NC，阴性对照。
图3。
图3。
miR-30a-3p抑制EC109细胞的迁移和侵袭。使用（A）划痕法和（B）Transwell法测定转染miR-30a-3p模拟物或miR-30a-3p抑制剂48 h的EC109细胞的迁移能力。（C） 通过Transwell侵袭试验评估转染EC109细胞的侵袭能力。在放大×200倍的倒置显微镜下对每个孔中的细胞进行计数。（D） western blot分析MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平。数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差；每项试验均一式三份**与对照组相比，P<0.01。##与NC组相比，P<0.01。miR，microRNA；基质金属蛋白酶；NC，阴性对照。
图4。
图4。
miR-30a-3p调节细胞周期和凋亡。用流式细胞术检测miR-30a-3p对EC9706和EC109细胞（A）细胞周期和（B）细胞凋亡的影响。数据表示为三个独立实验平均值的平均值±标准误差*与对照组相比，P<0.05，**P<0.01。#P<0.05，##与NC组相比，P<0.01。AV，膜联蛋白V；miR，microRNA；NC，阴性对照；PI，碘化丙啶。
图5。
图5。
miR-30a-3p抑制食管癌细胞的EMT。通过western blot分析，在转染miR-30a-3p模拟物或miR-30a-3p抑制剂48 h的EC9706和EC109细胞中测定EMT相关蛋白（E-cadherin、vimentin和N-cadherin）的表达水平。数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差**与对照组相比，P<0.01。##与NC组相比，P<0.01。上皮-间充质转化；miR，microRNA；NC，阴性对照。
图6。
图6。
miR-30a-3p增强食管癌细胞的放射敏感性。用miR-30a-3p模拟物或miR-30a-3p抑制剂转染EC9706和EC109细胞，并用不同辐射剂量（0、2、4、6和8 Gy）照射48 h。随后进行细胞计数试剂盒-8分析以评估细胞增殖。数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差，每个实验一式三份*与对照组相比，P<0.05、**P<0.01。miR，microRNA；NC，阴性对照；OD，光密度。
图7。
图7。
IGF-1R是miR-30a-3p的直接靶点。（A） 通过TargetScan预测miR-30a-3p和IGF-1R之间的相互作用。（B） 进行萤光素酶报告基因测定以验证miR-30a-3p与IGF-1R的3′-UTR的结合。（C） 在用miR-30a-3p模拟物或miR-30a-3p抑制剂转染后，采用逆转录定量聚合酶链反应和（D）western blotting分别评估IGF-1R mRNA和蛋白表达水平。使用ImageJ软件量化带强度。数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差；每项试验均一式三份**与对照组相比，P<0.01。##与NC组相比，P<0.01。胰岛素样生长因子1受体；miR，microRNA；MUT，突变体；NC，阴性对照；3′-UTR，3′-非翻译区；WT，野生型。
图8。
图8。
IGF-1R在EC组织和细胞系中上调。通过（A）免疫组织化学、（B）RT-qPCR和（C）western blot分析评估IGF-1R在EC组织和配对正常组织中的表达水平。通过（D）RT-qPCR和（E）western blot分析测定HET-1A、EC9706和EC109中IGF-1R的表达水平。使用ImageJ软件量化带强度。数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差；每项试验均一式三份**与对照组相比，P<0.01。食管癌；胰岛素样生长因子1受体；NC，阴性对照；RT-qPCR，逆转录定量聚合酶链反应。
图9。
图9。
沉默IGF-1R抑制食管癌细胞的增殖和EMT。（A） 用si-IGF-1R转染EC9706和EC109细胞后，通过逆转录定量聚合酶链反应分析测定转染效率。（B） 将转染si-IGF-1R的EC9706和EC109细胞用不同的辐射剂量（0、2、4、6和8 Gy）照射48 h，然后进行细胞计数试剂盒-8分析以评估细胞的增殖。（C） western blot分析测定转染si-IGF-1R的EC9706和EC109细胞中EMT相关蛋白（E-cadherin、vimentin和N-cadherin）的表达水平。使用ImageJ软件量化带强度。数据以三个独立实验的平均值±标准差表示；每项试验均一式三份*与空白组相比，P<0.05和**P<0.01。##与NC组相比P＜0.01。上皮-间充质转化；胰岛素样生长因子1受体；NC，阴性对照；si，小干扰RNA。
图10。
图10。
沉默IGF-1R抑制食管癌细胞的迁移和侵袭。（A） 通过刮伤试验测定转染si-IGF-1R的EC9706和EC109细胞48小时的迁移能力。（B） 使用Transwell侵袭试验评估转染si-IGF-1R 48 h的EC9706和EC109细胞的侵袭能力。在放大×200倍的倒置显微镜下对每个孔中的细胞进行计数。数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差；每项试验均一式三份**与空白组相比，P<0.01。##与NC组相比，P<0.01。胰岛素样生长因子1受体；NC，阴性对照；si，小干扰RNA。
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