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.2019年4月1日；9(4):730-739.
2019年eCollection。

HMGB1通过RAS-JNK/p38信号调节HL-60/NRAS中橡皮素诱导的铁凋亡Q61L问题细胞

叶芳华 1, 柴文文 2, 谢敏（音） 1, 杨明华 1, 严羽 1, 曹丽芝 1, 杨良春 1
附属公司
  • 采购管理信息： 31105999
  • 预防性维修识别码： PMC6511643型

HMGB1通过RAS-JNK/p38信号调节HL-60/NRAS中橡皮素诱导的铁凋亡Q61L问题细胞

叶芳华等。 美国癌症研究杂志. .

摘要

脱铁症是一种新的细胞死亡形式，由氧化损伤驱动，以铁依赖的方式促进脂质过氧化。高迁移率族盒1（HMGB1）在白血病发病机制和化疗耐药中起着重要作用。铁下垂在肿瘤发病机制和治疗中的机制已成为最近的研究热点，但HMGB1在调节铁下垂尤其是白血病中的作用仍不清楚。在这里，我们证明HMGB1是在表达NRAS的HL-60细胞系中eratin诱导的铁凋亡的关键调节器Q61L问题（HL-60/NRASQ61L问题). Erastin增强了ROS水平，从而促进HMGB1的胞质易位并促进细胞死亡。敲除HMGB1降低了擦除素诱导的HL-60/NRAS铁介导溶酶体途径中ROS的生成和细胞死亡Q61L问题细胞。敲除HMGB1或大鼠肉瘤（RAS），或药物抑制JNK和p38降低HL-60/NRAS中的TfR1水平第61季度细胞。重要的是，我们的体内实验进一步支持了这些数据，其中HMGB1击倒HL-60/NRAS形成的异种移植物Q61L问题细胞PTGS2和TfR1的表达低于对照组小鼠。综上所述，这些结果表明HMGB1是通过RAS-JNK/p38通路调控铁下垂的一种新型调节物，是白血病治疗干预的潜在药物靶点。

关键词：HMGB1；MAPK；急性髓系白血病；铁下垂；转铁蛋白受体1。

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利益冲突声明

没有。

数字

图1
图1
伊拉斯汀促进ROS依赖的核外HMGB1易位。A.用指定剂量的erastin处理不同类型的白血病细胞48小时、测定细胞内MDA水平和细胞活力（n＝3*P（P）与未治疗组或其他细胞系相比<0.05）。B和C.HL-60/NRASQ61L问题用橡皮素（5μM）处理细胞，加或不加Fer-1（1μM）预处理48h，然后用免疫荧光和western blot（Green，HMGB1；blue，nucleus）检测核/细胞溶质HMGB1的表达。D.HL-60/NRASQ61L问题用橡皮素（5μM）处理细胞24-72小时，有或没有Fer-1（1μM）预处理。用ELISA分析HMGB1的释放(n个= 3, *P（P）<0.05，与erastin加Fer-1治疗组相比）。E.在HL-60/NRAS中测定细胞内MDA水平Q61L问题在没有或存在EP（5 mM）的情况下，用橡皮素处理细胞24-72小时(n个= 3, *P（P）< 0.05). F.HL-60/NRAS公司Q61L问题用橡皮素（5μM）处理细胞24-72小时，有或没有（EP，5 mM）预处理。通过在荧光板读数器上测量DCF的荧光强度来评估ROS的产生。活性氧的增量产量表示为对照组的百分比(n个= 3, *P（P）与橡皮素+EP治疗组相比，<0.05）。G.HL-60/NRAS公司Q61L问题用对照siRNA载体和SOD1 siRNA转染细胞，通过western blot验证SOD1的表达。HL-60/NRASQ61L问题用橡皮素（5μM）处理细胞48小时，加或不加NAC（25 mM）或SOD1 RNAi或对照RNAi预处理。western blot检测HMGB1的细胞溶胶表达。所有实验均一式三份，数据表示为平均值±SD.Ctrl，对照；UT，未经处理；Fer-1，铁抑素-1；EP，丙酮酸乙酯；NAC，N-乙酰半胱氨酸。
图2
图2
HMGB1的耗尽抑制橡皮素诱导的细胞死亡和抗癌活性。A.HL-60/NRASQ61L问题用HMGB1 shRNA1或对照shRNA载体转染细胞，通过蛋白质印迹验证HMGB1的表达。然后，用所示剂量的橡皮素刺激两组细胞48小时。测定细胞活力。(n个= 3, *P（P）与对照组相比<0.05）。B.HL-60/NRASQ61L问题用HMGB1 shRNA1或对照shRNA载体转染细胞，然后用橡皮素（5μM）刺激细胞，用或不用指示的抑制剂刺激48小时。(n个= 3, *P（P）与仅用橡皮素治疗控制shRNA组相比，<0.05#P（P）>0.05与仅用橡皮素治疗控制shRNA组相比**P（P）>0.05与未经处理的HMGB1 shRNA组相比）。C和D.HL-60/NRASQ61L问题用HMGB1 shRNA1和对照shRNA载体转染细胞，然后用橡皮素（5μM）刺激48 h，测定GPX4和细胞内MDA水平(n个= 3, *P（P）与对照组相比<0.05）。E.HL-60/NRAS的超微结构特征Q61L问题用HMGB1 shRNA1和对照shRNA载体转染的细胞加上橡皮素（5μM）处理（白色箭头，正常线粒体；黑色箭头，萎缩线粒体）。F.HL-60/NRASQ61L问题用HMGB1 shRNA1和对照shRNA载体转染细胞，然后用DMSO、橡皮素（5μM）和H刺激细胞2O（运行）2（50 mM）48 h。测定培养基中的LDH水平。H（H）2O（运行）2作为阳性对照。UT，未经处理。(n个= 3, *P（P）< 0.05). G.HL-60/NRAS公司Q61L问题用HMGB1 shRNA1和对照shRNA载体转染细胞，然后用橡皮素（1.25μm）结合阿糖胞苷（Ara-C，0.375μg/mL）在没有或存在指示抑制剂的情况下刺激细胞48小时。(n个= 3, *P（P）与仅用橡皮素治疗控制shRNA组相比，<0.05#P（P）与橡皮素加阿糖胞苷治疗对照shRNA组相比<0.05**P（P）>与未处理的HMGB1 shRNA1组相比为0.05）。所有实验均一式三份，数据表示为平均值±SD.DFO、去铁胺；Fer-1，铁抑素-1；NEC-1，坏死抑素-1；3-甲基腺嘌呤；阿糖胞苷。
图3
图3
HMGB1的缺乏限制了铁介导的ROS生成和细胞死亡。A和B.HL-60/NRAS第61季度细胞分别用DMSO或橡皮素（5μM）处理0-48小时。如材料和方法部分所述，使用MitoTracker Red（50 nM）和DIOC6（1μM）分别通过流式细胞术对完整线粒体和线粒体膜电位进行量化(n个= 3, *P（P）> 0.05). C.HL-60/NRASQ61L问题用橡皮素（5μM）结合DFO（0.1 mM）、DPI（5μM）和新喋呤（50 nM）处理细胞48 h。通过在荧光板阅读器上测量DCF的荧光强度来评估ROS生成。ROS的增量产量表示为对照组的百分比。D、 二甲基亚砜；E、 橡皮擦。(n个= 3, *P（P）> 0.05, **P（P）< 0.05). D.HL-60/NRASQ61L问题用HMGB1 shRNA1和对照shRNA载体转染细胞，然后用含有或不含FeCl的橡皮素（5μM）刺激细胞三（30μM，预处理3h）48h，然后用PGSK对细胞进行染色，并用流式细胞仪分析染色细胞的荧光图谱。E、 橡皮擦。E和F.HL-60/NRAS第61季度用HMGB1 shRNA1和对照shRNA载体转染细胞，然后用橡皮素（5μM）结合DFO（0.1 mM）和Fer-1（1μM）刺激48 h。测定细胞内MDA水平和细胞活力。D、 二甲基亚砜；E、 橡皮擦。(n个= 3, *P（P）< 0.05, **P（P）> 0.05). G和H.HL-60/NRASQ61L问题用HMGB1 shRNA1和对照shRNA载体转染细胞，然后用含有或不含FeCl的橡皮素（5μM）刺激细胞三（30μM，预处理3小时）48小时。然后测定细胞内MDA水平和细胞活力。(n个= 3, *P（P）< 0.05, **P（P）> 0.05). 在所有实验中都使用了前列腺素-1预处理。所有实验均一式三份，数据表示为平均值±SD.D，DMSO；E、 橡皮素；DFO，去铁胺；DPI，二苯碘氯化铵。
图4
图4
HMGB1调节RAS-JNK/p38依赖通路中的TfR1表达。A.HL-60/NRASQ61L问题用橡皮素（5μM）和/或Fer-1（1μM）处理细胞后进行裂解，然后用western blot验证TfR1的表达。B.HL-60/NRAS第61季度用TfR1 siRNA和对照siRNA转染细胞，通过western blot验证TfR1。然后用橡皮素以指定剂量刺激两组细胞48小时。测定细胞活力。Ctrl，control。(n个= 3, *P（P）与对照组相比<0.05）。C.HL-60/NRASQ61L问题用橡皮素（5μM）联合SP600125（10μM）和SB202190（10μM）处理细胞48 h。western blot检测TfR1的表达和p38（p-p38）和JNK1/2（p-JNK1/2）的磷酸化。D.HL-60/NRASQ61L问题用NRAS siRNA和对照siRNA载体转染细胞，通过western blot验证NRAS的表达。然后用橡皮素（5μM）刺激两组细胞48小时。用Western blot检测TfR1、p-P38和p-JNK1/2。Ctrl，control。E.HL-60/NRAS公司Q61L问题用HMGB1 shRNA1和HMGB1 shRNA2转染细胞并控制shRNA载体，然后用橡皮素（5μM）刺激48 h。用western blot检测TfR1、p-P38和p-JNK1/2的表达水平。F.HL-60/NRAS公司Q61L问题用HMGB1质粒和空载体转染细胞，并通过蛋白质印迹验证HMGB1的表达。然后，用橡皮素（5μM）联合SP600125（10μM）和SB202190（10μM）刺激两组细胞48 h。用western blot检测TfR1的表达。在所有实验中都使用了前列腺素-1预处理。所有实验均一式三份，数据表示为平均值±SD。Fer-1，Ferostatin-1。
图5
图5
HMGB1表达下调抑制了橡皮素在体内的抗癌活性。将HMGB1 shRNA1 HL-60/NRAS皮下注射给A-C.NOD/SCID小鼠Q61L问题电池（1×106细胞/小鼠）并用erastin（20mg/kg静脉注射，每隔一天两次）从第七天开始处理两周。每周测量两次肿瘤体积和动物体重。实验结束时，移除所有异种移植物并称重(n个=4只小鼠/组*P（P）< 0.05, **P（P）> 0.05, #P（P）> 0.05). 实验结束时分离肿瘤中PTGS2和TfR1基因表达的D和E.qPCR分析(*P（P）< 0.05, **P（P）> 0.05). F.实验结束时，对一个孤立的肿瘤进行TfR1免疫组织化学染色。所有实验均一式三份，数据表示为平均值±SD。
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