PI3K-Yap activity drives cortical gyrification and hydrocephalus in mice

doi:10.7554/eLife.45961

.2019年5月16日8:e45961。

doi:10.7554/eLife.45961。

PI3K-Yap活性驱动小鼠皮层旋转和脑积水

阿奇拉·罗伊¹, 罗里·墨菲¹, 梅登², 詹姆斯·麦克唐纳³, 西奥·K·巴姆勒³, 金伯利·阿奥尔丁格^1 2, 伊恩·A·格拉斯², 凯萨琳·J·米伦^1 2

附属公司

¹美国华盛顿西雅图儿童研究所综合大脑研究中心。
²美国华盛顿大学儿科遗传医学部。
³美国华盛顿大学公共卫生学院环境与职业健康科学系。

PMID： 31094678
预防性维修识别码： PMC6544437型
内政部： 10.7554/寿命45961

PI3K-Yap活性驱动小鼠皮层旋转和脑积水

阿奇拉·罗伊等。埃利夫. 2019.

.2019年5月16:8:e45961。

doi:10.7554/eLife.45961。

作者

阿奇拉·罗伊¹, 罗里·墨菲¹, 梅登², 詹姆斯·麦克唐纳³, 西奥·K·班姆勒³, 金伯利·阿奥尔丁格^1 2, 伊恩·A·格拉斯², 凯萨琳·J·米伦^1 2

附属公司

¹西雅图儿童研究所综合大脑研究中心，美国华盛顿。
²美国华盛顿大学儿科遗传医学部。
³美国华盛顿大学公共卫生学院环境与职业健康科学系。

PMID： 31094678
预防性维修识别码： PMC6544437型
内政部： 10.7554/eLife.45961

摘要

驱动大脑折叠启动的机制尚不完全清楚。我们之前已经描述了再现人类的小鼠模型PIK3CA公司-相关的脑过度生长、癫痫、发育不良性回旋和脑积水（Roy等人，2015年）。使用同样的高度可调节的脑特异性模型，我们报告了正常光滑的小鼠皮层回旋和脑积水的PI3K依赖机制。我们证明，短暂的胚胎Pik3ca激活足以驱动心尖细胞粘附和亚细胞Yap移位的细微变化，导致局部增殖并随后启动天然脑回哺乳动物中常见的定型“旋回化序列”。用核Yap抑制剂维替泊芬治疗，恢复了心尖表面完整性、正常增殖、减弱回旋并挽救了相关的脑积水，突显了PI3K-Yap信号调节在正常神经室管膜发育中的相关作用。我们的数据将心尖细胞粘附定义为已知最早的皮层旋转基底。此外，我们的临床前结果支持Yap相关小分子治疗发育性脑积水的试验。

关键词：PI3K；雅普；皮质旋转；临界期；人类生物学；脑积水；药物；小鼠；神经科学。

PubMed免责声明

利益冲突声明

AR、RM、MD、JM、TB、KA、IG、KM未宣布竞争利益

数字

图1。 — **图1.胚胎诱导*匹克3ca^H1047R型*激活突变导致小鼠皮层旋转。**
(**a–d**)P3对照组和*GFAP-核心；派克3ca^H1047R型*突变的半脑在胚胎期诱导时显示出海马（虚线）和新皮质旋转（开放箭头）。(**e、（f）**)对照和变异海马的3D模型。(**克–升**)如Ctip2、Satb2和Tbr1表达所示，所有海马亚结构的大体模式完整。内侧回转主要局限于突变的CA1区。CA–山茱萸（红色虚线，**a–d**); 亚室；DG–齿状回（蓝色虚线，a-d；**g–j**). 比例尺：1 mm(**a–d**)，100微米(**n–s个**). 另请参见图1-图补充1–3。

图1——图补充1。 — **图1—图补充1……的遗传策略*匹克3ca^H1047R型*小鼠模型及其表达*GFAP-芯*行。**
(一)的示意图*PIK3CA公司*功能域，突出显示*H1047R型*激活突变，修改自Roy等人（2015）。(b条)tet-activated的遗传策略*匹克3ca^H1047R型转基因*小鼠（Liu等人，2011）：人类*派克3ca^H1047R型*突变在以下因素联合作用下被激活*cre公司*重组酶和强力霉素（dox）。逆转录四环素控制的反式激活剂。(**c、 d日**)*GFAP-芯*使用Ai14报告系在E14.5和E16.5的表达，与侧端脑相比，内侧端脑的表达更强；方框表示感兴趣的区域。Nctx，新皮质；LV、侧脑室、CA、山茱萸；DG，齿状回。比例尺：500μm，1 mm(**c（c）**).

图1—图补充2。 — **图1-图补充2匹克3ca^H1047R型突变的新皮质和海马。**
(**a–e、k–o**)在对照无脑出生后小鼠大脑中，新皮质和海马的心室（顶部）和软脑膜（底部）表面光滑且相互平行，任何中间细胞层或白质的厚度没有明显差异（绿色箭头(**b、 d、l、n**)). 这是用尼塞尔染色法证明的(**a、 k个**)和在示意图中(**e、 j个**). Ctip2、Satb2在侧脑室（LV）两侧的皮质板（CP）和海马锥体层（CA1 PL）上有差异标记。(**f–j，p–t**)产后*GFAP-核心；匹克3ca^H1047R型*如示意图所示，突变小鼠大脑的外侧新皮质和海马CA1均显示出真正的回转标准（Borrell，2018）(**j、 t吨**). Nissl染色和免疫组化分析显示突变体软脑膜表面、白质（wm）和神经元层（CP、CA1 PL）折叠，但主要是平滑的心尖部心室表面。变异脑回的相对厚度（脑室远端的褶皱；黄色/橙色箭头）比相邻变异脑沟的相对厚度更大（脑室近端的褶皱；蓝色箭头），这是正常脑回哺乳动物的特点。需要注意的一点：*匹克3ca^H1047R型*突变体大脑也显示出一定程度的神经元迁移缺陷（本研究；Roy等人，2015）。在所有面板中，实线标记心室边缘；虚线区分祖细胞区、白质和神经元区，虚线标记软脑膜边缘。在示意图中(**e、 j、o、t**)，软脑膜表面为紫色，神经元板为蓝色，白质为淡黄色，心室-室下区为粉红色。slm–*腔隙分子层*，所以–*地层oriens*.比例尺：200μm(**a–d、f–I、k–n、p–s**).

图1-图补充3。 — **图1——补充图3。。*匹克3ca^H1047R型*突变体显示心室长度增加。**
(**a、 c、e**)P3、E14.5和E16.5对照组和*匹克3ca^H1047R型*由E0.5中的多西环素诱导的突变体前脑。(b条)P3 CA1和齿状回（DG）的归一化长度分别以红色和蓝色虚线表示(一)与对照组相比，突变体中的时间明显更长（CA1:t=6.372，df=7.197；DG:t=2.698，df=7165）。(**d、（f）**)心室内侧壁的标准长度，如图所示(**c、 e（电子）**)在对照胚胎（黄色虚线）和突变体胚胎（红色虚线）中，与对照相比，突变体在E14.5（t=4.065，df=111.16）和E16.5（t=8.267，df=14.4）处的时间明显更长。开放箭头标志着E16.5突变体前脑皮质褶皱的出现。数据在散点图中表示为平均值±SEM；进行了双尾非配对t检验(**b、 d、f**). 比例尺：1 mm(一)，300微米(**c（c）**)，500微米(**e（电子）**).

图2。 — **图2匹克3ca^H1047R型胚胎和出生后阶段的突变体遵循刻板的皮层“回转序列”。**
(一)E14.5和E16.5冠状半切示意图，方框表示感兴趣区域(**b、 d、f、h、j**). 图像的方向是：外侧新皮质位于顶部，其次是侧脑室（LV），然后是CA1(**b、 d、f、h、j、l–o’**). (**b–e类**)与对照相比，E14.5匹克3ca^H1047R型突变体的标记指数明显较高，表明其增殖率较高。尽管E16.5突变体CA1在标记指数、pHH3方面没有明显变化⁺标记M期的细胞似乎是异位的（黄色箭头），表明分裂细胞的早期错位。(**f–i型**)与相应的控制装置E14.5和E16.5相比*GFAP-核心；匹克3ca^H1047R型*由E0.5诱导的突变体在初级（顶端Sox2⁺Tbr2型^-，aRGs）和次级（Tbr2⁺IP；基础Sox2⁺Tbr2型^-，bRGs）祖细胞池，符合旋回序列；黄色圆圈表示bRG。数据被归一化，并在散点图中表示为平均值±SEM；进行了双尾非配对t检验(**c、 e、g、i**). (**j、 k个**)突变CA1在E15.5-E16.5期间的细胞周期退出显著高于对照，如平均值±SEM散点图所示（t=10.16，自由度（df）=21.73）。(**l–m’**)与对照组相比，P3突变体CA1区的Pax6表达有局部增加⁺和Tbr2⁺脑室-脑室下区的祖细胞；根尖边缘主要保持未展开状态。(**n–o’**)内斯汀⁺和GFAP⁺P3中间丝方向错误，与突变体脑回的焦点（星号）不同(第页)P3对照和突变半切示意图；方框表示l-o’中显示的区域。差异显著，p<0.05；ns，不显著。nctx，新皮质；PL，金字塔层。比例尺：50μm(**b、 d、f、h、j**)，100微米(**l–o’**). 另请参见图2-图补充1。

图2——图补充1。 — **图2——图补遗1。。*匹克3ca^H1047R型*突变体表现出正常的细胞命运规范，但破坏了神经支架和迁移。**
(一)出生测定实验大纲：E16.5注射BrdU，P0（B16.5；P0）分析。(**b、 c（c）**)在P0处，Ctip2的总数⁺E16.5（BrdU）出生的细胞⁺)，和Ctip2的⁺E16.5（Ctip2）处生成的电池⁺/溴化铀⁺;d日)在各自的对照组和*匹克3ca^H1047R型*突变体CA1区域，表明PI3K过度激活对CA1中细胞命运规范没有影响。数据在散点图中表示为平均值±SEM；进行了2尾非配对t检验（Ctip2⁺：t=0.7623，df=10.24；BrdU公司⁺：t=0.8534，df=6.91；BrdU公司⁺Ctip2公司⁺：t=1.752，df=6.61；**b–d段**). 差异显著，p<0.05；ns，不显著。(**e–j**)雀巢⁺E14.5中的放射状胶质纤维稍不规则*匹克3ca^{2004年1月17日}*突变体(**（f）**)但在E16.5时逐渐变为超网状和异常增生形态(**d、 j个**)与各自的控制相比(**e、 g、i**). 层粘连蛋白⁺与相应的对照组相比，突变基膜在E14.5处较薄，在E16.5处较厚。此外，E16.5突变体PL广泛分布，并显示出*腔隙分子层*（slm；j个). (k个)E14.5、E16.5的示意图（标有区域的方框如所示(**e–j**))和P2半切。(**l、米**)钙结合蛋白⁺通常沿着P2控制的CA1PL（箭头）心室侧排列的细胞严重分散（开放箭头），聚集在突变体脑回区的白质周围。(**n、 o个**)与对照相比，P2突变体表现出更多的Reelin⁺沿着旋转神经组织的细胞，但在异位部位未发现细胞。比例尺：25μm(**e–j、i–o**).

图3。 — **图3.中的非随机回转模式*匹克3ca^H1047R型*突变体的胚胎临界期较窄。**
(**a–j**)尼塞尔染色冠状半切面描绘海马形态和示意图(**e、 j个**). 与对照组相比(一),*派克3ca^H1047R型*突变体海马表现出不同程度的回旋，这取决于突变诱导的时间和持续时间。具有非随机折叠模式的最严重折叠的临界期在E15.5结束(**b–d段**). 产后诱导*匹克3ca^H1047R型*突变对引起皮层旋转无效(我). (k个)突变诱导的发育时间表和相应的海马回转表型。比例尺：1 mm(**a–d，f–i**). 另请参见图3-图补充1。

图3——图补充1。 — **图3补充图1。PI3K过度激活的最小诱导足以启动E17.5 CA1中的皮层折叠和改变的神经元迁移。**
(一)显示分级诱导突变体的P3 CA1长度的图表，归一化为E0.5诱导的突变体的长度。与E15.5之前诱导的突变相比，E15.5之后诱导的突变显示出显著降低的CA1长度。数据在散点图中表示为平均值±SEM；采用Tukey多重比较试验进行单因素方差分析（F-value=20.57，df=42）。(**b–e类**)P0的Nissl染色冠状切片*派克3ca^H1047R型*突变体（强力霉素：E13.5>E14.5；E14.5>E15.5）与相应的对照窝友相比，表现出轻微的皮层发育不良和脑室扩大，但很少出现回旋。(**f–v型**)E17.5突变，从E13.5到E15.5最低程度诱导，显示出折叠的第一个视觉迹象，如尼塞尔染色冠状面不同前后段所示(**A–P公司**)飞机(**f–g“，n**)当处理Pax6、Tbr2时(**h、 k个**)，Ctip2(**i、我**). 第一个起伏区域用开放箭头标记(**k、我**). Reelin-Laminin免疫组化显示基底膜稍厚但未明显破坏，Reelin较长⁺区域（虚线）；然而，在突变体海马中未观察到Reelin的异位表达(**j、 m、r、v**). 与对照组相比(**o、第页**)，E17.5匹克3ca^H1047R型突变体（dox:E13.5>E15.5）显示出超纤维素酶Nestin⁺放射状胶质支架(秒)，较厚的分散Ctip2⁺PL伴异位Calbindin⁺单元格(t吨). 突变体显示严重减少*腔隙分子层*（slm）（星号；u个)，在控制部分用L1标记（箭头；q个). 突变体*地层oriens*（所以）看起来很正常。DG–齿状回。比例尺：1 mm(**b–e类**)，500微米(**f–g“，n**)，200微米(**小时–分钟**)，50微米(**o–v型**).

图4。 — **图4.胚胎诱导*匹克3ca^{2004年1月17日}*突变导致心尖细胞粘附的早期破坏。**
(**a、 j个**)显示感兴趣区域的E14.5和E16.5半剖面示意图。(**b–i类**)与对照相比，E16.5匹克3ca^H1047R型由E0.5诱导的突变体显示前脑顶膜（开放箭头(**f–h**)XZ平面显示细胞粘附分子β-连环蛋白和ZO-1的微小错位(**d、小时**). N-钙粘蛋白，通常在顶膜并列处均匀表达(**e（电子）**)，似乎聚集在未拉链部分周围，在膜连接的相邻部分偶尔缺失（星号）(我). (**k–r（k–r）**)与对照组相比，E14.5突变体的CA1心室壁在β-连环蛋白、N-钙粘蛋白、ZO1的定位方面显示出轻微的破坏，如白色箭头所示(**o–q号**)和星号(第页). bv–血管。标尺：20μm(**b–i，k–r**). 另请参见图4-图补充1。

图4——图补充1。 — **图4补充图1。胚胎诱导PI3K过度激活导致的心尖细胞粘附中断在出生后持续存在。**
(一)P3控制和示意图*匹克3ca^H1047R型*突变体；方框显示感兴趣的区域。(**b–d段**)P3对照切片显示新皮质和海马顶膜跨侧脑室并置，β-连环蛋白和N-Cadherin（白色箭头）均匀表达和共定位。(**e–j**)相比之下，P3突变沟显示β-连环蛋白和N-钙粘蛋白（星号(**e–g**)而突变的脑回显示出分散的共定位区域（开放箭头），其间散布着N-Cadherin的单独表达和非拉链边缘的异位细胞(**h–j小时**). 请注意，心室肥大在P3突变体中非常明显(**e–j**). 比例尺：20μm(**b–j**).

图5。 — **图5.胚胎诱导*匹克3ca^H1047R型*突变破坏早期发育的室管膜并诱导nYap增加⁺细胞。**
(**a、 n个**)P3、E16.5和E14.5半切面示意图；方框区域表示感兴趣的区域。(**b-d，o，o’p，s，s’**)室管膜标记物Yap和Vimentin以及连接蛋白ZO-1分别定位于P3、E16.5和E14.5对照CA1的顶端衬里。此外，Yap和ZO-1标记血管膜（bv），而Vimentin标记海马放射状胶质细胞。(**e（电子）**)P0突变的CA1脑室壁显示存在局灶性nYap富集区（箭头，橙色方框），沟（青色方框）散布着Yap稀疏区。(**f、我**)Yap增加⁺P3突变体脑回（开放箭头）和Yap稀疏突变体脑沟边缘（星号）的细胞核表明室管膜受到破坏。(**g、 j个**)ZO-1在P3突变的脑室回区外显表达，沟区有断裂。(**h、 k个**)波形蛋白⁺纤维在脑回处呈小时规律排列；沟道显示出更多的定向纤维和间隙（星号）；虚线标记室管膜底缘。(**l、米**)nYap的总数和分布⁺与对照窝友相比，P3突变体中不同CA1亚区（以单层顶缘、心室-室下区（vz/svz）、白质（wm）和CA1锥体层（CA1 PL）为单元）的细胞显著增强（总数：F=179.1，df=28；细胞分布：F=137.8，df=86）。对照CA1显示nYap的最小存在⁺vz/svz以外的单元格。数据在散点图中表示为平均值±SEM(我)或100%堆叠柱(米); 分别进行单向和双向方差分析。(**o–q’**)与对照相比，E16.5派克3ca^H1047R型突变体显示前脑顶膜拉链异常，并伴有局部nYap表达（箭头）。(**s–t’**)与对照组相比，E14.5突变的内侧根尖膜显示出细胞粘附的轻微破坏，导致轻微的屈曲/不均匀。E14.5和E16.5心室边缘的放大图像显示nYap数量较高⁺与对照组相比，突变体（黄色虚线）中的细胞(**o’，q’，s’，t’**); 一些非nYap⁺为了便于比较，单元格用粉红色虚线标记(**o'，s'，t'**). 比例尺：20μm(**b–d、f–k、o–t**)，500微米(**e（电子）**)，10微米(**o’，q’，s’，t’**). 另请参见图5——图补充1。

图5——图补充1。 — **图5——图补充1..Six3⁺细胞异位地集中在突变的回旋心室区。**
(一)对照组CA1心室边缘在P0时未强烈表达室管膜标志物Six3，尽管在有丝分裂后层观察到正常的Six3表达（数据未显示）。(**b–d段**)P0突变gyri显示Six3浓度⁺细胞核（箭头），类似于突变的nYAP表达（见图5），而它们分散在心室区缺乏的沟中（星号）。(**e（电子）**)显示脑回和脑沟位置的P0突变示意图。bv–血管；LV–侧脑室。比例尺：20μm(**a–c**)，100微米(d日).

图6。 — **图6：维替泊芬将Yap从细胞核转移到细胞质后，可减弱胃的回旋和心室扩大*匹克3ca^H1047R型*突变体。**
(一)维替泊芬给药的发展时间表（E13.5>E18.5）。(**b–d段**)尼氏染色显示P0区回转减弱，无心室肥大*匹克3ca^H1047R型*维替泊芬给药后突变（诱导E13.5>E15.5）。方框标记了各自的兴趣区域(**e–g**). (**e–g**)标记心室-室下区组织样品的激光捕获显微切割（LCM）流程图，以及RNA测序。星号(**c、（f）**)未经治疗的突变体大脑中标记新皮质的回旋，最终也被维替泊芬减弱(**d、克**). (小时)主成分（PC）分析表明，维替泊芬给药可驱动心室*匹克3ca*突变基因向对照组织表达。PC1主要由PI3K信号传导解释，PC2主要由Hippo-Yap信号传导解释。(我)显示PI3K过度激活和维替泊芬治疗对*匹克3ca*.比例尺：1 mm(**b–d段**)，500微米(**e–g**). 另请参见图6，图补充1–3，图6，源数据1和2。

图6——图补充1。 — **图6：补充图1：服用维生素A对对照组同窝婴儿没有明显影响。**
(**a–j**). 维替泊芬治疗并未明显影响Ctip2、放射状胶质细胞标记物Nestin和Vimentin、中间祖细胞标记物Tbr2、细胞粘附分子如β-连环蛋白、ZO-1、N-Cadherin、室管膜标记物Yap和Six3的正常表达以及整体脑形态。方框输入(我)描述了感兴趣的区域。(**k、我**)Verteporfin治疗也没有明显影响P0对照CA1和突变沟室管膜发育中Six3的表达；然而，它大大降低了Six3的焦点浓度⁺变异脑室回区的细胞（星号）。(米)显示脑回和脑沟位置的P0突变体（维替波芬治疗）示意图。bv–血管。比例尺：20μm(**a–h、j–l**)，1毫米(我).

图6——图补充2。 — **图6补充了2。跨组的条形码图，显示基因富集。**
(**a–d**)显示PI3K通路和Hippo-YAP通路基因富集的条形码图，用于以下比较：突变沟（无药物）与对照（无药物；p_PI3K系列=2.02秒⁻²⁰，第页_雅普=2.35e⁻¹⁸)变异脑回（无药物）与对照组（无药物；p_PI3K系列=4.92e⁻²⁰，第页_雅普=3.33秒⁻¹⁸)，突变沟（+维替波芬）与突变沟（无药物；p_PI3K系列=7.74e⁻¹⁹，第页_雅普=2.05秒⁻¹⁷)和变异脑回（+维替泊芬）与变异脑回_PI3K系列=1.96e⁻¹⁹，第页_雅普=5.67e⁻¹⁸). 图的中央部分显示了所有基因的排名列表，按p值排序，最小的p值在左侧，最大的在右侧。集合中的基因用彩色条高亮显示：红色和蓝色条分别标记上调和下调基因。“权重”显示了两组之间的对数倍变化，给出了影响大小的度量，外部图（标记为“富集”）显示了集合中基因的相对富集。因此，富集图突出了那些提供证据表明整个基因集正在差异表达的基因。

图6——图补充3。 — **图6——补充图3。。*匹克3ca*突变回转与生理相关。**
(一)一组重要的旋回相关雪貂基因（GSE60687）的条形码图，映射到小鼠，用于以下比较：突变体沟与对照组（无药物；p=9.65e⁻²¹); 突变体脑回与对照组（无药物；p=1.57e⁻²¹)变异沟与脑回（无药物；p=1.64e⁻¹⁹). 这些图表明，雪貂数据和我们的老鼠数据之间映射的顶级基因在我们的数据集中受到很大影响。(b条)维恩图表明，与雪貂正常回转相关的基因与小鼠突变回转区差异表达的基因有显著重叠。(**c（c）**)P0对照和突变半切的示意图，指示感兴趣的区域。

图7。 — **图7：维替泊芬降低nYap可重建发育中的心尖连接并抑制局部增殖*匹克3ca^{2004年1月17日}*突变体。**
(一)P0控制和突变体（±verteporfin）前脑半切的示意图；方框描述了各自感兴趣的领域。(**b–g**)P0对照组未经治疗的大脑沿并列的顶膜均匀表达cYap、粘附连接蛋白ZO-1和放射状胶质标记物Vimentin和Nestin。Ctip2和Tbr2分别在锥体神经元和IP中表达。(**h–s’**)与未经治疗的P0（dox E13.5>E15.5）突变体脑回和脑沟相比，Verteporfin治疗显著使Yap定位从细胞核到细胞质正常化，恢复了顶端连接，并使放射状胶质支架断裂。(**t、 u个**)治疗显著降低了总nYap⁺突变海马回和脑沟的细胞数量（F=70.47，df=32）以及nYap的正常化⁺细胞分布到对照水平（F=134.4，df=96）。这也显著降低了Tbr2⁺祖细胞群体（F=31.45，df=35），尤其是突变的旋回区，如(**v（v）**). 这导致脑回化程度减弱，并使心尖膜重新收缩，以阻止进行性心室肥大。数据在散点图中表示为平均值±SEM(t吨); 双向方差分析后进行Tukey的后测。ns，不显著。突变体中开放箭头、断裂/异位连接和室管膜蛋白；星号，突变体顶端边缘无粘附/室管膜分子；箭矢，挽救了变异后维替泊芬治疗中的心尖心室衬里；bv，血管；左心室，侧脑室。标尺：20μm(**b–s’**). 另请参见图7图补充1–2。

图7——图补充1。 — **图7补充图1.维替泊芬降低nYap可重建细胞粘附*匹克3ca^H1047R型*突变体。**
(**a–c**)细胞粘附分子，即β-连环蛋白、N-Cadherin，在P0（dox E13.5>E15.5）对照脑中沿并列的顶膜均匀特异表达。(**d–i’**)在未经治疗的P0（dox E13.5>E15.5）突变体脑回和脑沟中观察到，维替泊芬治疗恢复了受损的顶端细胞粘附。这导致回旋程度减弱，心尖膜重新拉链，以阻止进行性心室扩大。(**j–l**)P0控制和突变体（±脊椎鳍）前脑半切的示意图；方框描述了各自感兴趣的领域。星号，突变体顶端边缘无粘附/室管膜分子；箭矢，挽救了变异后维替泊芬治疗中的心尖心室衬里；bv，血管；左心室，侧脑室。比例尺：20μm(**a–i’**).

图7——图补充2。 — **图7补充图2。维替泊芬对心尖连接的影响早期开始。**
(一)维替泊芬给药的发展时间表（E13.5>E16.5）。(**b、 c（c）**)E16.5的Nissl染色冠状切片*匹克3ca^H1047R型*突变体和对照（诱导的E13.5>E15.5），在维他泊芬给药后，显示出相似的形态。方框标记各自感兴趣的区域。(**d–g’**)Verteporfin处理的突变体显示连接蛋白的排列增加，祖细胞库正常化，顶端膜解压缩的发生减少（与图4相比）。虚线表示心尖部心室壁。(小时)凋亡研究显示TUNEL的数量没有显著差异（F=0.3318，df=32）⁺E16.5控制区和突变（±Verteporfin）CA1区之间的细胞。数据表示为散点图中的平均值±SEM；进行单因素方差分析，然后进行Tukey后验。bv，血管；虚线，侧脑室。标尺：500μm(**b、 c（c）**)，20微米(**d–g’**).

图8。 — **图8.概要：PI3K-Yap回转模型。**
(一)PI3K-AKT-MTOR通路示意图，其与Yap信号转导和维替泊芬作用模式的联系。PI3K酶（催化亚单位和调节亚单位的二聚体）的活性启动PI3K-AKT-MTOR途径级联。同时，在Hippo途径的下游，Yap与细胞核中的转录调节蛋白结合，以促进细胞生长和增殖。Hippo通路的激活导致核Yap通过磷酸化转位到细胞质。细胞质Yap反过来促进细胞粘附。激活*匹克3ca*突变导致Yap从细胞质易位到细胞核，可能是通过Pdk1。在这项研究中，核Yap抑制剂维替泊芬恢复了细胞质Yap。(**b、 c（c）**)总结论文主要发现的示意图：PI3K过度激活导致神经-室管膜过渡区的细胞粘附中断，导致心室扩大，也导致祖细胞的差异增殖，从而触发旋转序列级联（基因型的影响）。在突变小鼠中，维替泊芬减弱了这些异常（药物的作用），导致回转严重程度和心室扩大程度降低。顶行黄色虚线框内的区域(b条)和(**c（c）**)在相应的底部行中放大。中元素的颜色编码(b条)和(**c（c）**)如图“键”所示。vz/svz，心室/室下区。

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