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.2019年6月；54(6):2095-2105.
doi:10.3892/ijo.2019.4789。 Epub 2019年4月16日。

HOXA6通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制肾透明细胞癌细胞增殖并诱导凋亡

吴飞翔 1, 吴莎莎 2, 恒通（Hang Tong） 1, 魏阳河 1, 新沟 1
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HOXA6通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制肾透明细胞癌细胞增殖并诱导凋亡

吴飞翔等。 国际肿瘤杂志. 2019年6月.

摘要

透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是最常见的肾细胞癌类型，该病的发病率正在增加。本研究旨在探讨同源异型盒A6（HOXA6）在ccRCC细胞增殖和凋亡中的作用。GSE6344数据集和免疫组织化学分析表明，在ccRCC组织中HOXA6的mRNA和蛋白表达水平受到抑制。为了评估HOXA6在细胞增殖和凋亡中的作用，用表达HOXA6、空载体、短发夹（sh）HOXA6和非靶向shRNA（NC）的质粒转染ccRCC细胞系（786‑O和769‑P）。采用细胞计数试剂盒‑8、集落形成和5‑乙炔‑2’‑脱氧尿苷染色分析细胞增殖。此外，还进行了胱天蛋白酶-Glo和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记试验来检测细胞凋亡。此外，通过流式细胞仪分析786‑O和769‑P细胞的细胞周期和凋亡率。结果表明，与空载体组相比，HOXA6过度表达后786‑O和769‑P细胞的增殖降低；然而，与NC组相比，shHOXA6组的细胞增殖增加。与空载体组相比，HOXA6‑过度表达细胞的凋亡率增加，而shHOXA6组的凋亡率与NC组相比降低。此外，流式细胞术表明，上调HOXA6表达水平可抑制G0/G1期细胞周期。Western blotting结果显示，过表达HOXA6的细胞中，磷脂酰肌醇3‑激酶（PI3K）、磷酸化（p）‑蛋白激酶B（Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen‑activated protein kinase kinase）、p‑胞外信号调节激酶（ERK）和B‑细胞淋巴瘤2（Bcl-2）的表达水平受到抑制；然而，与空载体组相比，磷酸酶和张力蛋白同源物、Bcl‑2‑相关X蛋白、裂解半胱天冬酶‑3和裂解多聚（ADP‑核糖）聚合酶的蛋白表达水平增加。shHOXA6组与NC组的结果相反。总之，结果表明HOXA6抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，这可能通过抑制PI3K/Akt/ERK级联而发生。这些发现表明HOXA6在ccRCC中的作用；然而，潜在的机制需要进一步研究。

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数字

图1
图1
HOXA6在癌组织和转染细胞系中的表达及生存分析。（A） 从GSE6344中提取的10对ccRCC肿瘤和正常组织中HOXA6的mRNA表达水平。***与正常值相比，P<0.001。（B） ccRCC患者的生存分析，使用基因表达谱交互分析进行。（C） 免疫组织化学检测HOXA6蛋白在ccRCC和正常组织中的表达。***与正常值相比，P<0.001。（D） HOXA6在转染细胞系中的表达。**与矢量或NC相比，P<0.01。***与向量相比，P<0.001。透明细胞肾细胞癌；HOXA6，同源盒A6；RT-qPCR、逆转录定量聚合酶链反应；矢量，仅矢量控制；NC，阴性对照；shHOXA6、HOXA6短发夹RNA；ACTB，β-肌动蛋白；TPM，外显子模型每千碱基百万映射读数的转录本。
图2
图2
HOXA6在细胞增殖中起作用。（A） 通过细胞计数试剂盒-8测定细胞增殖。***与载体或NC相比，P<0.001。（B）通过集落形成试验检测细胞增殖。（C） 用DAPI和EdU染色的细胞被认为是增殖阳性的。**与矢量相比P<0.01；*P<0.05，***P<0.001 vs.NC（放大倍数，×200）。（D） 通过流式细胞术进行细胞周期分析。*P<0.05，**与载体或NC.EdU，5-乙炔基-2′-脱氧尿苷相比P<0.01；HOXA6，同源盒A6；矢量，仅矢量控制；NC，阴性对照；shHOXA6，HOXA6短发夹RNA。
图3
图3
通过Caspase-Glo、TUNEL和流式细胞仪分析细胞凋亡。（A） Caspase-Glo分析检测细胞凋亡。*P<0.05，**P<0.01，***与载体或NC相比P<0.001。（B）TUNEL和DAPI染色的细胞被认为是凋亡的，*与矢量或NC相比，P<0.05（放大倍数，×200）。（C） 通过流式细胞术分析细胞凋亡。*与NC相比P<0.05，**与矢量相比，P<0.01。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记；HOXA6，同源盒A6；矢量，仅矢量控制；NC，阴性对照；shHOXA6、HOXA6短发夹RNA；PI，碘化丙啶；异硫氰酸荧光素。
图4
图4
蛋白质印迹法用于分析PI3K/Akt信号通路中的蛋白质。与载体组相比，HOXA6组PI3K、p-Akt、MEK、p-ERK和Bcl-2的表达水平受到抑制，但PTEN、Bax、裂解caspase-3和裂解PARP的表达水平增加。shHOXA6组与NC组的结果相反。*P<0.05，**P<0.01，***与载体或NC.Akt、蛋白激酶B相比，P<0.001；PI3K，磷脂酰肌醇3-激酶；p、 磷酸化；PTEN、磷酸酶和张力蛋白同源物；MEK，丝裂原活化蛋白激酶激酶；ERK，细胞外信号调节激酶；Bax，B细胞淋巴瘤2相关X蛋白；Bcl-2，B细胞淋巴瘤2；PARP，聚ADP核糖聚合酶；HOXA6，同源盒A6；矢量，仅矢量控制；NC，阴性对照；shHOXA6，HOXA6短发夹RNA。
图5
图5
通过Transwell和创伤愈合分析测量细胞迁移。（A） 采用Transwell法检测细胞迁移情况。**与载体或NC相比，P<0.01。（B）进行伤口愈合试验以检测细胞的迁移。***P<0.001 vs.矢量或NC.HOXA6，同源盒A6；矢量，仅矢量控制；NC，阴性对照；shHOXA6，HOXA6短发夹RNA。
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