TRAF4 positively regulates the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells by acting as an E3 ubiquitin ligase to degrade Smurf2

doi:10.1038/s41418-019-0328-3

.2019年12月；26（12）：2652-2666。

doi:10.1038/s41418-019-0328-3。 Epub 2019年5月10日。

TRAF4作为E3泛素连接酶降解Smurf2，积极调节间充质干细胞的成骨分化

李金腾^#^1 2, 王鹏（音译）^#^1 2, 谢忠余^#^1 2, 王珊（Shan Wang）³, 岑水中², 李明（音）², 刘文杰², 苏安堂², 叶贵文², 管正², 苏红军³, 马梦君^1 2, 吴晓华³, 吴彦峰⁴, 沈慧永^5 6

附属公司

¹中山大学附属第八医院骨科，中国深圳。
²中华人民共和国广州市中山大学孙中山纪念医院骨科。
³中华人民共和国广州中山大学中山纪念医院生物治疗中心。
⁴中华人民共和国广州中山大学中山纪念医院生物治疗中心。wuyf@mail.sysu.edu.cn。
⁵中山大学附属第八医院骨科，中国深圳。shenhuiy@mail.sysu.edu.cn。
⁶中华人民共和国广州中山大学中山纪念医院骨科。shenhuiy@mail.sysu.edu.cn。

^#贡献均等。

PMID： 31076633
预防性维修识别码： PMC7224386号
内政部： 10.1038/s41418-019-0328-3

TRAF4作为E3泛素连接酶降解Smurf2，积极调节间充质干细胞的成骨分化

李金腾等。细胞死亡不同. 2019年12月.

.2019年12月；26(12):2652-2666.

doi:10.1038/s41418-019-0328-3。 Epub 2019年5月10日。

作者

李金腾^#^1 2, 王鹏（音译）^#^1 2, 谢忠宇^#^1 2, 王珊（Shan Wang）³, 水忠岑², 李明（音）², 刘文杰², 苏安堂², 叶贵文², 管正², 苏红军³, 马梦君^1 2, 吴晓华³, 吴彦峰⁴, 沈慧永^5 6

附属公司

¹中山大学附属第八医院骨科，中国深圳。
²中华人民共和国广州中山大学中山纪念医院骨科。
³中华人民共和国广州中山大学中山纪念医院生物治疗中心。
⁴中华人民共和国广州中山大学中山纪念医院生物治疗中心。wuyf@mail.sysu.edu.cn。
⁵中山大学附属第八医院骨科，中国深圳。shenhuiy@mail.sysu.edu.cn。
⁶中华人民共和国广州中山大学中山纪念医院骨科。shenhuiy@mail.sysu.edu.cn。

^#贡献均等。

PMID： 31076633
预防性维修识别码： PMC7224386号
内政部： 10.1038/s41418-019-0328-3

摘要

TNF受体相关因子4（TRAF4）是TRAF家族的成员，在骨系统的胚胎发生和发育中起重要作用。间充质干细胞是体内成骨细胞的主要来源，是骨发育的关键细胞；然而，TRAF4是否调节MSCs的成骨能力尚不清楚。在本研究中，我们证明TRAF4在体内外均能积极调节MSCs的成骨过程。此外，我们进一步证明TRAF4通过作为E3泛素连接酶调节MSCs的成骨过程，以介导K119位点Smurf2的K48连接泛素化并导致降解。此外，去势大鼠和骨质疏松症患者的骨切片中TRAF4异常减少。总之，我们的研究结果表明TRAF4通过作为E3泛素连接酶降解Smurf2，积极调节MSCs的成骨分化。这些结果强调了TRAF4在骨形成中的关键作用，不仅可以提高MSCs在组织工程中的临床应用，还可以阐明骨代谢障碍的发病机制。

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数字

图1
TRAF4在MSCs成骨分化过程中上调。MSCs在成骨培养基中培养14天。一ARS染色（比例尺 = 250 µm）显示从第0天到第14天钙结节形成逐渐增加（黑色箭头）。b条ALP染色（比例尺 = 250 µm）在第10天达到峰值，随后下降（黑色箭头）。**c（c）**TRAF4蛋白水平在诱导成骨谱系后上调，并在成骨过程中保持较高水平。d日TRAF4蛋白表达与骨髓间充质干细胞成骨分化过程中ARS定量和ALP活性呈正相关。所有数据均以平均值表示 ± 标准偏差*第页 < 0.05 (n个 = 三个不同MSC线的独立实验）

图2
TRAF4在体外正调控MSCs的成骨分化。慢病毒用于减少和过度表达MSCs中的TRAF4。一通过ARS染色（比例尺 = 250 µm，黑色箭头）。b条在ALP分析中，TRAF4的敲除导致染色减少，而TRAF4过度表达导致MSCs成骨过程中染色增加（比例尺 = 250 µm，黑色箭头）。**c（c）**通过western blot测定成骨相关标记物Runx2和OCN的蛋白水平。MSCs中TRAF4的减少降低了Runx2和OCN在成骨诱导过程中的表达，而TRAF4过度表达则有相反的作用。所有数据均以平均值表示 ± 标准偏差*第页 < 0.05 (n个 = 三个不同MSC线的独立实验）

图3
TRAF4在体内正调控MSCs的成骨分化。将MSCs加载到支架上并植入裸鼠皮下。一实验装置示意图(n个 = 每组9人）。b条H&E染色（比例尺 = 100 µm）显示，Sh-TRAF4组的新形成骨组织少于NC1组，而OE-TRAF3组的类骨形成大大增加，而NC2组则相反（黑色箭头）。**c（c）**马森三色染色（比例尺 = 100 µm）表明，与NC1组相比，TRAF4敲除显著减少胶原组织的形成（染蓝），而TRAF4过度表达显著增加骨样组织的形成，与NC2组相比（黑色箭头）

图4
TRAF4减少Smurf2的表达以调节MSCs的成骨过程。一SDS-PAGE分离的共免疫沉淀混合物的考马斯蓝染色。b条共免疫沉淀混合物用SDS-PAGE分离并用western blot进行评价。MSCs中内源性TRAF4和Smurf2相互作用。**c（c）**免疫荧光分析显示TRAF4和Smurf2在MSCs中共定位（绿色TRAF4、红色Smurf2、蓝色DAPI）。d日与NC1组相比，Sh-TRAF4组Smad1和Runx2蛋白水平降低，Sh-Smurf2组升高，而与Sh-TRAF组相比，Sh-TRAF4/Sh-Smurv2挽救了Smad1与Runx2的表达。与NC2组相比，OE-TRAF4组的Smad1和Run2蛋白水平增加，OE-Smurf2组的Smad1和Runx2蛋白水平降低，而OE-TRAF4/OE-Smurf2组的Smad1和Runx2蛋白表达水平与OE-TRAF4组相比降低。**e（电子）**与Sh-TRAF4组相比，同时敲除TRAF4和Smurf2增加了ARS和ALP染色（比例尺 = 250 µm，黑色箭头），同时TRAF4和Smurf2的过度表达将ARS和ALP染色降低至NC2组与OE-TRAF4组相比观察到的水平（比例尺 = 250 µm，黑色箭头）。中的数据(d日)和(**e（电子）**)表示为手段 ± 标准偏差*第页 < 0.05 (n个 = 三个不同MSC线的独立实验）

图5
TRAF4以泛素/蛋白酶体依赖的方式诱导Smurf2降解，TRAF4通过TRAF域与Smurf2结合，其对Smurf2的降解功能依赖于RING和TRAF域。一用Myc-TRAF4或空载体将Flag-Smurf2转染293T细胞。质粒转染36天后 h、在用10 μM环己酰亚胺和Flag-Smurf2蛋白水平。结果表明，与Myc-TRAF4共表达时，Flag-Smurf2降解率较高。b条293T细胞中36例同时表达Flag-Smurf2和Myc-TRAF4 h、然后用氯喹（CQ，50）处理293T细胞 µM）或MG132（10 µM）用于另一个12 h.Western blotting表明，MG132可以逆转Myc-TRAF4介导的Flag-Smurf2降解，而CQ几乎没有作用。**c（c）**将TRAF4-WT或TRAF4突变体与Flag-Smurf2共表达到293T细胞中后，用抗Myc免疫沉淀Myc-TRAF4，并用western blotting在IP复合物中检测到Flag-Smurf2。结果表明，TRAF结构域介导了TRAF4和Smurf2之间的相互作用，RING结构域缺失突变体和TRAF结构区缺失突变体均导致TRAF4失去降解Flag-Smurf2的能力。所有数据均以平均值表示 ± 标准偏差*第页 < 0.05 (n个 = 3个独立实验）

图6
TRAF4作为E3泛素连接酶，通过K48泛素链泛素化Smurf2的K119位点并降解Smurf2。HA-Ubiquitin、Myc-TRAF4和Flag-Smurf2共表达到293T细胞后36 h、收集细胞裂解物，用抗Flag免疫沉淀Flag-Smurf2。一Western blotting显示Myc-TRAF4显著诱导Flag-Smurf2的泛素化。b条,**c（c）**Myc-TRAF4显著诱导Flag-Smurf2的K48连接泛素化，而不是K63连接泛素。d日从TRAF4中删除RING结构域或TRAF结构域导致TRAF4失去诱导Smurf2泛素化的能力。**e（电子）**Smurf2的一个催化失活突变（半胱氨酸716转化为丙氨酸）不影响依赖TRAF4的泛素化和Smurf2降解。**（f）**免疫沉淀标志-Smurf2的考马斯蓝染色与Myc-TRAF4共表达或SDS-PAGE分离的空载体。克将119个赖氨酸残基突变为精氨酸（K119R）显著降低了TRAF4介导的Smurf2泛素化，TRAF4失去了降解Smurf2表达的能力。结果如所示(**e（电子）**)和(克)表示为手段 ± 标准偏差*第页 < 0.05 (n个 = 3个独立实验）

图7
TRAF4在骨质疏松大鼠和患者的骨切片中减少。为了评估TRAF4在体内骨重塑中的可能功能意义，我们制作了OVX大鼠作为绝经后骨质疏松的动物模型。一显示OVX大鼠和假手术大鼠骨小梁丢失的典型显微CT图像（白色箭头）。b条代表性H&E染色（比例尺 = 100 μm）的骨小梁丢失（黑色箭头）。**c（c）**卵巢切除大鼠的小梁数目减少。d日OVX大鼠的骨体积减少。**e（电子）**免疫荧光染色（比例尺 = 50 µm）证明TRAF4在OCN中较弱⁺与假手术大鼠相比，OVX大鼠的成骨细胞谱系（白色箭头）。**（f）**免疫荧光染色（比例尺 = 50 µm）证明TRAF4在OCN中的表达较弱⁺骨质疏松患者的成骨细胞谱系高于对照组（白色箭头）。克免疫荧光染色（比例尺 = 50 µm）证明在OCN中Smurf2表达增加⁺OVX大鼠与假手术大鼠的成骨细胞谱系比较（白色箭头）。小时免疫荧光染色（比例尺 = 50 µm）证明在OCN中Smurf2表达增加⁺骨质疏松患者与对照组患者的成骨细胞谱系比较（白色箭头）

图8
TRAF4在成骨细胞分化中的功能示意图。TRAF4作为E3泛素连接酶，在K119位点介导Smurf2的K48连接泛素化，并导致降解，从而积极调节MSCs的成骨过程

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