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.2019年12月；15(12):2142-2162.
doi:10.1080/15548627.2019.1615822。 Epub 2019年5月22日。

通过有丝分裂清除受损线粒体对肾脏缺血预处理的保护作用很重要

曼·利文斯顿 1, 王景洪 2, 周继良 三, 吴光裕 三, 伊恩·甘利 4, 约瑟夫·希尔 5, 尹晓明 6, 郑东 1 2
附属公司

通过有丝分裂清除受损线粒体对肾脏缺血预处理的保护作用很重要

曼·利文斯顿等。 自噬. 2019年12月.

摘要

缺血预处理（IPC）对包括肾脏在内的器官提供组织保护；然而，其潜在机制尚不清楚。在这里，我们证明了大量自噬/自噬（尤其是有丝分裂）在IPC对肾脏的保护作用中的重要作用。IPC诱导小鼠肾小管细胞自噬并抑制随后的肾缺血再灌注损伤（IRI）。IPC的保护作用通过自噬的药物抑制剂和附件7来自肾脏近端小管。BECN1/Beclin1肽预处理诱导自噬并对IRI具有保护作用。这些结果表明IPC保护对肾脏自噬的依赖性。在IPC期间，有丝分裂调节因子PINK1（PTEN诱导的假定激酶1）被激活。IPC和BECN1肽均能增强有丝分裂报告小鼠肾脏IRI期间的丝裂小体形成，表明IPC可能通过激活有丝分裂来保护肾脏。我们进一步用羰基氰化物3-氯苯肼（CCCP）诱导肾近端小管细胞的“化学缺血”，建立了IPC的体外模型。CCCP的短暂治疗可以保护这些细胞免受随后的损伤，并且这种保护作用被自噬抑制所抵消。体外IPC可增加线粒体吞噬体的形成，增强线粒体吞噬体向溶酶体的传递，并在随后的CCCP治疗中促进受损线粒体的清除。IPC还抑制线粒体去极化，提高ATP生成，并抑制活性氧的生成。击倒粉红色1抑制有丝分裂，降低IPC的细胞保护作用。总之，这些结果表明自噬，尤其是有丝分裂，在IPC的保护作用中起着重要作用。缩写：ACTB：肌动蛋白，β；ATG：自噬相关；BNIP3:BCL2相互作用蛋白3；BNIP3L/NIX:BCL2相互作用蛋白3样；BUN：血尿素氮；CASP3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；CCCP：羰基氰化物3-氯苯肼；COX4I1：细胞色素c氧化酶亚基4I1；COX8：细胞色素c氧化酶亚基8；DAPI:4'，6-二氨基-2-苯基吲哚；DNM1L：dynamin 1样；EGFP：增强型绿色荧光蛋白；EM：电子显微镜；ER：内质网；FC：浮控；FIS1：分裂，线粒体1；FUNDC1:FUN14域包含1；H-E：苏木精-伊红；HIF1A：缺氧诱导因子1亚单位α；HSPD1：热休克蛋白家族D（Hsp60）成员1；IMMT/MIC60：线粒体内膜蛋白；IPC：缺血预处理；I-R：缺血再灌注；IRI：缺血再灌注损伤；JC-1:5,5'，6,6'-四氯-1,1'，3,3'-四乙基苯并咪唑基碳菁碘化物；KO：淘汰赛；MAP1LC3B/LC3B：微管相关蛋白1轻链3β；mito-QC：mito-质量控制；mRFP：单体红色荧光蛋白；NAC：N-乙酰半胱氨酸；PINK1:PPTEN诱导的推定激酶1；PPIB：肽基丙基异构酶B；PRKN:parkin RBR E3泛素蛋白连接酶；ROS：活性氧物种；RPTC：大鼠近端肾小管细胞；SD：标准偏差；sIPC：模拟IPC；SQSTM1/p62：隔离体1；TOMM20：线粒体外膜转位酶20；TUNEL：末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记。

关键词：急性肾损伤；自噬；缺血预适应；有丝分裂；近端小管；肾脏缺血再灌注。

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数字

图1。
图1。
肾脏IPC对C57BL/6小鼠肾脏IRI具有保护作用。小鼠双侧肾缺血15分钟，然后再灌注1小时，以诱导肾IPC。为了诱导肾脏IRI，随后对小鼠进行27分钟双侧肾缺血治疗，然后再灌注24至48小时（假手术：n=3；I-R:n=7；IPC+I-R:n=10）。在指定的时间点采集血液和肾脏，进行肾功能、组织学和免疫印迹分析。（a） BUN公司。（b） 血清肌酐。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与假手术组有显著差异；#，P（P）<0.05，与I-R组差异显著。（c） 肾皮质和外髓质的典型组织学H-E染色。比例尺：50µm。（d） 肾小管损伤的病理评分。（e） TUNEL染色的代表性图像。比例尺：50µm。（f） TUNEL阳性细胞的定量。（d和f）中的数据表示为平均值±SD.*，P（P）<0.05，与I-R组差异显著。（g） 裂解CASP3的代表性斑点和密度分析。ACTB被用作加载控制。用ACTB归一化后，假样本的蛋白质信号被任意设置为1，其他条件的信号被归一化为假样本，以计算折叠变化。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与假手术组有显著差异；#，P（P）<0.05，与I-R组差异显著。
图2。
图2。
肾IPC过程中近端小管自噬的诱导。C57BL/6（a–e）和CAGp-RFP-GFP-LC3（f–h）小鼠只接受肾脏IPC，而没有随后的肾脏IRI（C57BL-6小鼠：假手术组：n=3；IPC:n=6；CAGp-RPP-GFP-LC3小鼠：各n=3）。预处理后收集肾脏进行组织学和免疫印迹分析。（a） LC3B和SQSTM1的代表性斑点。ACTB被用作加载控制。（b） LC3B-II和SQSTM1的密度分析。用ACTB标准化后，假手术的蛋白质信号被任意设置为1，其他条件的信号被标准化为假手术，以计算折叠变化。（c） LC3B免疫组化染色的代表性图像。比例尺：20µm。（d） 点状LC3B染色的定量分析。（b和d）中的数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与假手术组有显著性差异。（e） 显示自噬空泡的典型电子显微照片（箭头）（每个n=2）。比例尺：2µm（3个上面板）和200 nm（6个下面板）。（f） GFP-LC3和RFP-LC3荧光染色的代表性图像。比例尺：15µm。（g） 黄色和红色LC3斑点的定量分析。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与假手术组有显著差异；#，P（P）<0.05，红色LC3点与黄色LC3点的相关值存在显著差异。（h） 自噬流量率分析。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与假手术组有显著性差异。
图3。
图3。
IPC对肾IRI的保护作用在PT中消失-第7天KO小鼠。（a） 絮凝控制（PT-附件7FC）和PT-第7天用假手术或IPC处理KO小鼠，收集肾脏进行LC3B和SQSTM1的免疫印迹分析（n=3）。ACTB被用作加载控制。浮动控制和PT-第7天KO小鼠接受：（1）假手术（n=3只）；（2） I-R（对于FC，n=8；对于KO，n=9）；（3） IPC+I-R（每个n=10）。在指定的时间点采集血液和肾脏，进行肾功能、组织学和免疫印迹分析。（b） BUN公司。（c） 血清肌酐。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与假手术组有显著差异；#，P（P）<0.05，与I-R组差异显著。（d） 肾皮质和外髓质的典型组织学H-E染色。比例尺：50µm。（e） 肾小管损伤的病理评分。（f） TUNEL染色的代表性图像。比例尺：50µm。（g） TUNEL阳性细胞的定量。（e和g）中的数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与I-R组差异显著。（h） 裂解CASP3的代表性斑点和密度分析。ACTB被用作加载控制。用ACTB标准化后，假手术的蛋白质信号被任意设置为1，其他条件的信号被标准化为假手术，以计算折叠变化。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与假手术组有显著差异；#，P（P）<0.05，与I-R组差异显著。
图4。
图4。
Tat-BECN1的药理学预处理对C57BL/6小鼠肾脏IRI具有保护作用。用Tat-BECN1及其对照肽（Tat-Scramble）对C57BL/6小鼠进行单剂量20 mg/kg i.p.注射预处理。预处理后4 h，小鼠遭受27分钟的双侧肾缺血，然后再灌注24至48小时（假手术：各3例；Tat-Scramble+I-R:n=8；Tat-BECN1+I-R:10）。在指定的时间点采集血液和肾脏，进行肾功能、组织学和免疫印迹分析。（a和b）BUN和血清肌酐。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与假手术组有显著差异；#，P（P）<0.05，与Tat-Scramble+I-R组有显著差异。（c） 肾皮质和外髓质的典型组织学H-E染色。比例尺：50µm。（d） 肾小管损伤的病理评分。（e） TUNEL染色的代表性图像。比例尺：50µm。（f） TUNEL阳性细胞的定量。（d和f）中的数据表示为平均值±标准差*，P（P）<0.05，与Tat Scramble+I-R组有显著差异。（g） 裂解CASP3的代表性斑点和密度分析。ACTB被用作加载控制。用ACTB归一化后，Tat-Scramble+sham的蛋白信号被任意设置为1，其他条件的信号被归一化为Tat-Scram+sham，以计算折叠变化。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与假手术组有显著差异；#，P（P）<0.05，与Tat-Scramble+I-R组有显著差异。
图5。
图5。
在随后的小鼠肾脏IRI期间，肾脏IPC和Tat-BECN1预处理均增强了近端小管的有丝分裂。（a） C57BL/6小鼠接受：（1）假手术（n=3）；（2） I-R（n=7）；（3） IPC+I-R（n=10）。收集肾脏进行PINK1、COX4I1、IMMT/MIC60和TOMM20的免疫印迹分析。PPIB（肽基脯氨酸异构酶B）被用作负荷控制。Mito-QC小鼠接受：（1）假手术（n=3）；（2） IPC（n=3）；（3） I-R（n=4）；（4） IPC+I-R（n=5）。采集肾脏，通过荧光显微镜测定线粒体吞噬通量。（b） 有丝分裂体形成的典型图像。比例尺：低倍率为20µm，高倍率为5µm。（c） 定量分析每400×视野（肾皮质和外髓质外条，肾小球除外）的分裂小体数量。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与假手术组有显著差异；#，P（P）<0.05，与I-R组差异显著。此外，用Tat-BECN1及其控制肽（Tat-Scramble）以20 mg/kg i.p.的单次剂量对mito-QC小鼠进行预处理。预处理4小时后，小鼠接受假手术或27分钟双侧肾缺血，然后再灌注48小时（每组3个）。采集肾脏，通过荧光显微镜测定线粒体吞噬通量。（d） 有丝分裂体形成的典型图像。比例尺：20µm。（e） 定量分析每400×视野（肾皮质和外髓质外条，肾小球除外）的分裂小体数量。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与假手术组有显著差异；#，P（P）<0.05，与Tat-Scramble+I-R组有显著差异。
图6。
图6。
体外sIPC可减弱长期CCCP诱导的RPTC细胞凋亡。通过将RPTC细胞与20μM CCCP孵育30分钟，然后恢复40分钟，体外诱导sIPC。然后用延长的CCCP（20μM）处理细胞3 h，然后恢复2 h，以建立活体肾IRI模型。收集细胞，通过形态学和caspase活化分析细胞凋亡。（a） 相位对比和荧光显微镜的代表性图像显示细胞和细胞核凋亡的形态。比例尺：200μm。（b） 细胞凋亡的量化。（c） 裂解CASP3的代表性斑点和密度分析。ACTB被用作加载控制。用ACTB归一化后，对照组的蛋白质信号被任意设置为1，其他条件的信号被归一化为对照组，以计算折叠变化。（b和c）中的数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与对照组差异显著；#，P（P）<0.05，与CCCP-R组差异显著。
图7。
图7。
RPTC细胞中的自噬抑制剂降低了体外sIPC的细胞保护作用。RPTC细胞接受：（1）对照；（2） CCCP-R；（3） sIPC+CCCP-R，不含或含有氯喹（20μM）和3-甲基腺嘌呤（10 mM）。这两种抑制剂分别用于1小时的预处理和2小时的从长期CCCP治疗中恢复。收集细胞进行形态学和免疫印迹分析。（a） 相位对比和荧光显微镜的代表性图像显示细胞和细胞核凋亡的形态。比例尺：200μm。（b） 细胞凋亡的量化。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与对照组差异显著；#，P（P）<0.05，与CCCP-R组差异显著。（c） sIPC对细胞凋亡抑制效率的分析。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与无抑制剂组相比差异显著。（d和e）LC3B和裂解CASP3的免疫印迹。ACTB被用作加载控制。分子质量标记线标记为kDa。对于裂解CASP3的密度分析，在用ACTB归一化后，对照组的蛋白质信号被任意设置为1，其他条件的信号被归一化为对照组，以计算折叠变化。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与对照组差异显著；#，P（P）<0.05，与CCCP-R组差异显著。
图8。
图8。
体外sIPC抑制线粒体去极化，提高ATP的产生，并减少长期CCCP处理的RPTC细胞中ROS的产生。RPTC细胞与1μg/ml JC-1孵育1h，然后处理：（1）对照；（2） CCCP-R；（3） 再灌注1h后采集sIPC+CCCP-R活细胞进行荧光显微镜观察。（a） JC-1染色的代表性图像显示JC-1聚集体的红色荧光和单体的绿色信号。比例尺：50μm。（b） 绿色与红色荧光比率的量化。（c） RPTC细胞接受：（1）对照；（2） CCCP-R；（3） sIPC+CCCP-R。再灌注30min后收集细胞，通过荧光素-荧光素酶发光法定量测定ATP。（b和c）中的数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与对照组差异显著；#，P（P）<0.05，与CCCP-R组差异显著。（d） RPTC细胞接受：（1）对照；（2） CCCP-R；（3） sIPC+CCCP-R；（4） CQ+sIPC+CCCP-R；（5） NAC+CCCP-R。处理后的细胞与5μM CellROX深红色试剂孵育30分钟。荧光显微镜观察ROS生成。比例尺：50μm。
图9。
图9。
击倒粉红色1抑制CCCP处理的RPTC细胞的有丝分裂流量。（a） RPTC细胞接受：（1）对照；（2） sIPC；（3） CCCP-R；（4） sIPC+CCCP-R。治疗后收集线粒体部分，对PINK1、PRKN、BNIP3L/NIX、FUNDC1和DNM1L等多种与有丝分裂相关的蛋白进行免疫印迹分析。HSPD1是一种线粒体基质蛋白，用作负荷控制。（b） RPTC细胞感染逆转录病毒粉红色1shRNA结构（A–D）和阴性对照（NC）结构。选择嘌呤霉素后，收集稳定细胞进行PINK1的免疫印迹分析。PPIB被用作加载控制。根据抑制作用，稳定细胞（阴性对照，粉红色1shRNA A，粉红色1shRNA C）转染COX8-EGFP-mCherry，然后处理：（1）对照；（2） CCCP-R；（3） sIPC+CCCP-R。收集细胞用于荧光显微镜检查。（c） 有丝分裂溶酶体形成的代表性图像。比例尺：10μm。（d） 定量分析每个细胞中有丝分裂体的数量。数据表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.05，与对照组差异显著；#，P（P）<0.05，与CCCP-R组有显著差异，P（P）<0.05，与阴性对照细胞相应组相比差异显著。
图10。
图10。
体外sIPC介导的细胞保护受到以下因素的影响粉红色1RPTC细胞中的敲除。RPTC稳定细胞系（阴性对照，粉红色1shRNA A，粉红色1shRNA C）的建立如图9所示。然后用以下方法处理细胞：（1）对照；（2） CCCP-R；（3） sIPC+CCCP-R。处理后收集细胞进行形态学、生化和免疫印迹分析。（a） 相位对比和荧光显微镜的代表性图像显示细胞和细胞核凋亡的形态。比例尺：200μm。（b） 细胞凋亡的量化。（c） 裂解CASP3免疫印迹的代表性图像。ACTB被用作加载控制。分子质量标记线标记为kDa。（d） 裂解CASP3免疫印迹的密度分析。用ACTB归一化后，阴性对照细胞中的对照蛋白信号被任意设置为1，其他条件的信号被归一化以计算折叠变化。（e） JC-1染色定量分析（绿色荧光与红色荧光的比率）。在CCCP治疗前，用1μg/ml JC-1加载细胞1小时。收集活细胞进行荧光显微镜检查。（f） ATP生成的生物发光分析。（b，d–f）中的数据表示为平均值±SD.*，P（P）<0.05，与对照组差异显著；#，P（P）<0.05，与CCCP-R组差异显著。
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    1. Pasupathy S，Homer-Vanniasinkam S。缺血预处理保护缺血/再灌注损伤：新兴概念。《欧洲血管内皮外科杂志》，2005年。2月；29(2):106–115. . 公共医疗PMID:15649715。-公共医学
    1. Bonvente合资公司。肾脏缺血预处理。肾性高血压。2002年1月；11(1):43–48. 公共医疗PMID:11753086。-公共医学
    1. Wever KE、Menting TP、Rovers M等。动物肾脏缺血预处理，系统综述和荟萃分析。《公共科学图书馆·综合》。2012;7（2）：e32296。PubMed PMID:22389693；公共医疗中心PMCID:PMCPMC3289650。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Kapitsinou PP，Haase VH.肾脏缺血预处理的分子机制。美国生理学杂志肾生理学。2015年11月15日；309（10）：F821–34。PubMed PMID:26311114；公共医疗中心PMCID:PMCPMC4652073。-项目管理咨询公司-公共医学

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