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.2019年5月6日;15(5):e1008084。
doi:10.1371/journal.pgen.1008084。 eCollection 2019年5月。

减数分裂门控STRA8通过抑制小鼠精子发生过程中Nr1d1的表达抑制自噬

附属公司

减数分裂门控STRA8通过抑制小鼠精子发生过程中Nr1d1的表达抑制自噬

Ianina C Ferder公司等。 公共科学图书馆-基因. .

摘要

从有丝分裂细胞周期到减数分裂细胞周期的转变对单倍体配子的形成和生育至关重要。受维甲酸基因8(Stra8)刺激是脊椎动物减数分裂起始的重要门卫;然而,STRA8的分子作用仍然主要未知。在这里,我们证明STRA8在小鼠精子发生过程中起到了抑制自噬的作用。Stra8-缺陷的生殖细胞不能进入减数分裂,并表现出自噬-溶酶体基因的异常上调,与自噬激活相当。生化测定表明,STRA8的异位表达单独足以抑制自噬诱导和成熟。研究还表明,核激素受体基因Nr1d1在Stra8缺陷的睾丸中上调,Stra8与Nr1d启动子结合,表明Nr1d1是Stra8转录抑制的直接靶点。此外,还发现NR1D1与Ulk1的启动子结合,Ulkl是自噬启动所必需的基因,而NR1D1是Stra8-缺陷睾丸中上调Ulk 1表达所必需的。此外,Nr1d1的基因缺失及其合成拮抗剂SR8278对Nr1d1的药理学抑制均对Stra8-缺陷雄性生殖细胞中观察到的减数分裂起始缺陷具有挽救作用。总之,数据表明STRA8介导的自噬抑制与减数分裂启动之间存在新的联系。

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数字

图1
图1。野生型和Stra8系列-睾丸缺陷。
(A类,B类)野生型睾丸横切面(A类)和Stra8系列-不足(B类)小鼠21日龄(澳大利亚,文学士)野生型睾丸横切面苏木精-伊红染色(澳大利亚)和Stra8系列-不足(文学士)老鼠。(抗体,Bb公司)野生型睾丸横切面的透射电镜观察(抗体)和Stra8系列-不足(Bb公司)老鼠。红色虚线的左边是精原细胞室(Spg)。虚线右侧是精母细胞室(Spc)。(交流-电子,Bc-e公司)精原细胞详细视图(交流电,密件抄送),精母细胞(广告,Bd公司),和支持细胞(Ae公司,Be公司)野生型(交流-电子)和Stra8系列-不足(Bc-e公司)睾丸。(Bd公司)中灯具隔间的详细视图Stra8系列-睾丸缺陷。(Bf-j公司)在中鉴定的自噬体Stra8系列-睾丸缺陷(箭头)。
图2
图2。体内RFP-GFP-LC3野生型和Stra8系列-睾丸缺陷。
(A类)来自RFP-GFP-LC3转基因小鼠幼年野生型和Stra8系列-共焦成像背景不足(上面板)。显示了相对于野生型样品每个成像区域的囊泡数量的量化。RFP阳性小泡总数。AL(自体溶酶体),RFP-阳性GFP-阴性囊泡。所有值均为平均值±SD。n=3只小鼠/基因型*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。(B类)RFP-GFP-LC3转基因小鼠幼年野生型和Stra8系列-背景不足。虚线表示生精小管。箭头表示自噬体。箭头表示自溶体(自噬体成熟)。显示了相对于野生型样品每个成像区域的囊泡数量的量化。RFP阳性小泡总数。AL(自体溶酶体),RFP-阳性GFP-阴性囊泡。所有值均为平均值±SD。n=3只小鼠/基因型*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。
图3
图3。p62的快速自噬降解Stra8系列-睾丸生殖细胞缺陷。
(A类)野生型和非野生型p62的免疫组织化学Stra8系列-21 d.p.p.时出现的睾丸缺陷。数字表明含有核p62积聚生殖细胞的生精小管的百分比。(B类)qRT-PCR分析平方米1野生型和Stra8系列-睾丸缺陷归一化为β-肌动蛋白.数据表示平均值±SD;每组n=3。注:不重要。(C类)p62和MVH的双重免疫荧光染色Stra8系列-用溶媒(PBS;左面板)或氯喹(CQ;右面板)治疗缺陷睾丸7天。(D类)在有或无氯喹处理的情况下,每个生精小管中表现出细胞质p62表达的MVH+生殖细胞数量的量化Stra8系列-睾丸缺陷。数据表示平均值±SD;n=每组3只动物;326个生精小管被检测Stra8系列-未经氯喹治疗的睾丸缺陷。296个生精小管被检测Stra8系列-氯喹治疗睾丸缺陷*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。
图4
图4。选择性自噬溶酶体基因的转录上调Stra8系列-睾丸缺陷。
野生型和野生型自噬和溶酶体基因的qRT-PCR分析Stra8系列-10 d.p.p.时的睾丸缺陷标准化为β-肌动蛋白.数据表示平均值±SD;n=每组5个*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。
图5
图5。STRA8抑制从头开始自噬诱导后的自噬体形成。
(A类)用EBSS处理2小时稳定表达GFP(Ctrl)或STRA8(标记GFP)的F9细胞的细胞裂解物,使用所示抗体进行Western blot分析。图中显示了LC3-II与肌动蛋白比率的量化。数据表示平均值±s.e.m;n=3个独立实验*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。(B类)用载体或雷帕霉素(Rapa;0.1μM)处理稳定表达GFP(Ctrl)或STRA8(标记GFP)的F9细胞裂解液2小时后,使用所示抗体进行Western blot分析。图中显示了LC3-II与肌动蛋白比率的量化。数据表示平均值±s.e.m;n=3个独立实验*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。(C类)用载体或二甲双胍(Met;2 mM)处理2小时稳定表达GFP(Ctrl)或STRA8(标记GFP)的F9细胞的细胞裂解物,使用所示抗体进行Western blot分析。图表显示了LC3-II与肌动蛋白比率的定量。数据表示平均值±s.e.m;n=3个独立实验*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。
图6
图6。STRA8在基础条件下抑制自噬体成熟(无自噬诱导)。
(A类)在正常条件下稳定表达GFP(Ctrl)或STRA8(标记有GFP)的F9细胞的细胞裂解物通过使用所示抗体进行Western blot分析。图表显示了LC3-II与肌动蛋白比率的量化。数据表示平均值±s.e.m。;n=3个独立实验*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。(B类)表达GFP(Ctrl)和STRA8的F9细胞的荧光显微镜图像,用抗LC3抗体染色,用氯喹处理或不处理2小时。图中显示了每个细胞LC3阳性点的量化。黑点代表LC3点。每组100个细胞计数每个细胞中LC3阳性点状细胞的数量。数据表示平均值±标准误差。;n=3个独立实验*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。(C类)用空(Ctrl)或STRA8-表达质粒转染稳定表达GFP-mRFP-LC3的HeLa细胞的代表性荧光图像。质粒转染HeLa细胞的效率约为80-85%。图表显示了自溶小泡(GFP-阴性RFP-阳性)在总小泡(mRFP-正)中的百分比。每组分析100个细胞。数据表示平均值±标准误差。;n=3个独立实验*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。(D类,E类)用载体或氯喹(CQ;20μM)处理2小时后,稳定表达GFP(Ctrl)和STRA8(标记GFP)的F9细胞的细胞裂解液用LC3进行Western blot分析(D类)或p62(E类)抗体。图中显示了LC3-II的量化(D类)或p62(E类)与肌动蛋白的比例。数据表示平均值±标准误差。;n=3个独立实验*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。(F类)对照F9细胞和稳定表达STRA8的F9细胞自噬和溶酶体基因的qRT-PCR分析。数据代表平均值±标准差;n=每组3个培养基*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。
图7
图7。STRA8抑制编号1d1表达式。
(A类)RNA-seq分析检测到短暂异位STRA8表达上调和下调基因。24小时后,从转染空载体(pCMV6)或STRA8的细胞中收集总RNA。(B类)原位杂交编号1d1年龄匹配的野生型和Stra8系列-10 d.p.p.时出现睾丸缺陷(C类)qRT-PCR分析编号1d1表达式相对于β-肌动蛋白未分化(c-Kit-阴性整合素α6-high)和分化精原细胞(c-Kit阳性整合素β6-low)水平Stra8系列-FACS检测睾丸缺陷。数据表示平均值±SD;n=3只/组*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。(D类)野生型和非野生型NR1D1和MVH的双重免疫荧光染色Stra8系列-睾丸缺陷。左图中的箭头表示野生型睾丸中不表达明显水平NR1D1的生殖细胞。右侧面板中的箭头表示生殖细胞位于Stra8系列-表达NR1D1的缺陷睾丸。注意生殖细胞Stra8系列-表达NR1D1的缺陷睾丸呈现双核,这是在精母细胞中常见的典型现象。在每种基因型中,对2只小鼠睾丸横截面上的至少60个细胞进行分析。数据表示平均值±SD*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。(E类)的示意图NR1D1型人类、小鼠、大鼠和斑马鱼的启动子显示出保守的E-盒。(F类)上部,针对人体电子盒的引物组示意图NR1D1型ChIP分析促进剂。左下方,STRA8 WT、mNLS和mHelix与NR1D1型瞬时转染后293T细胞E-Box的启动子。图表表示重复PCR反应的平均值±SD。右下角,ChIP分析显示STRA8 WT与NR1D1型基因。
图8
图8。上调需要NR1D1乌尔克1中的表达式Stra8系列-睾丸缺陷。
(A类)原位杂交乌尔克1年龄匹配的野生型和Stra8系列-10 d.p.p.时出现睾丸缺陷(B类)qRT-PCR分析乌尔克1表达式相对于β-肌动蛋白未分化(c-Kit-阴性整合素α6-high)和分化(c-Kit-阳性整合素β6-low)精原细胞水平Stra8系列-FACS检测睾丸缺陷。数据表示平均值±SD;n=3只/组*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。(C类)左侧面板,针对小鼠RORE位点的引物组示意图乌尔克1ChIP分析促进剂。下部,NR1D1与乌尔克121 d.p.p.时小鼠睾丸裂解物RORE位点的启动子。图中显示了三次PCR反应的平均值±SD。(D类)睾丸的qRT-PCR分析乌尔克1表达式相对于β-肌动蛋白显示基因型的睾丸中的水平。数据表示平均值±SD;n=3只/组*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。
图9
图9。基因和药理学NR1D1抑制可挽救减数分裂起始阻滞Stra8系列-睾丸缺陷。
(A类)苏木精/伊红染色的睾丸横切面的显微照片显示,在10 d.p.p.时,具有指定基因型的睾丸。插图显示生殖细胞在减数分裂早期表现出染色体凝聚。下面显示了包含生殖细胞的小管在减数分裂早期表现出染色体凝聚的百分比。数据表示平均值±标准偏差。n=2-3只小鼠/基因型。(B类)γ-H2AX和SYCP3的双重免疫荧光染色Stra8系列-/-;编号1d1+/+Stra8系列-/-;编号1d1-/-睾丸10 d.p.p.。注意SYCP3染色在Stra8系列-/-;编号1d1+/+与SYCP3核分布的生殖细胞和在Stra8系列-/-;编号1d1-/-睾丸。(C类)睾丸的qRT-PCR分析第11期,Dmc1公司、和Sycp3系统表达式规范化为β-肌动蛋白在10 d.p.p.下,从具有指定基因型的小鼠中提取。数据为平均值±SD;n=每组2-3只小鼠*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。(D)野生型和野生型苏木精/伊红染色睾丸横截面的显微照片Stra8系列-用溶媒或SR8278(100 mg/kg)治疗缺陷睾丸3天。在10 d.p.p.时采集睾丸。插图显示生殖细胞在减数分裂早期表现出染色体凝集。下面显示了包含生殖细胞的小管在减数分裂早期表现出染色体凝聚的百分比。数据表示平均值±标准偏差。n=3只小鼠/基因型。(E类)γ-H2AX和SYCP3的双重免疫荧光染色Stra8系列-用载体或SR8278处理的缺陷睾丸。(F类)睾丸的qRT-PCR分析第11期,Dmc1公司、和Sycp3系统表达式规范化为β-肌动蛋白用载体或SR8278处理的小鼠。数据为平均值±标准差;n=每组4-5只小鼠*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。
图10
图10。在减数分裂起始的发育窗口中,STRA8的缺失导致异常的自噬体形成和胎儿卵巢生殖细胞自噬溶酶体基因表达的上调。
(A、 B类)野生型卵巢横截面的透射电镜图像(A类)和Stra8系列-不足(B类)在胚胎第14.5天(E14.5)显示原始生殖细胞(PGC)的小鼠。箭头表示自噬体。(C、 天)野生型和野生型自噬和溶酶体基因表达的qRT-PCR分析Stra8系列-胎儿卵巢缺陷(C类)和睾丸(D类)E14.5标准化为生殖细胞含量百万伏特水平。数据表示平均值±SD;n=每组3个胚胎*P(P)<0.05(学生的t吨测试)。
图11
图11。STRA8-通过NR1D1-ULK1轴抑制自噬介导减数分裂启动的示意模型。

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