Epitope Presentation of Dengue Viral Envelope Glycoprotein Domain III on Hepatitis B Core Protein Virus-Like Particles Produced in Nicotiana benthamiana

doi:10.3389/fpls.2019.00455

.2019年4月16日10:455。

doi:10.3389/fpls.2019.00455。 2019年电子采集。

登革热病毒包膜糖蛋白结构域III在乙型肝炎核心蛋白病毒样颗粒上的表位表达本氏烟草

Ee Leen Pang先生¹, 哈德里安·佩雷特², 拉米瑞兹^三, Hwei-San Loh公司¹, Kok-Song Lai公司⁴, Chee-Mon Fang先生⁵, 威廉·罗森博格^三, 乔治·罗蒙诺索夫²

附属公司

¹马来西亚塞门耶诺丁汉大学生物科学学院。
²生物化学系，英国诺维奇约翰·因内斯中心。
^三iQur有限公司，英国伦敦。
⁴马来西亚Serdang马来西亚普特拉大学生物技术和生物分子科学学院。
⁵马来西亚塞门耶诺丁汉大学药学院生物医学系。

PMID： 31057572
预防性维修识别码： PMC6477658型
内政部： 10.3389/fpls.2019.00455

登革热病毒包膜糖蛋白结构域III在乙型肝炎核心蛋白病毒样颗粒上的表位呈递本氏烟草

Ee Leen Pang先生等。前植物科学. 2019.

.2019年4月16日10:455。

doi:10.3389/fpls.2019.00455。 2019年电子采集。

作者

Ee Leen Pang先生¹, 哈德里安·佩雷特², 拉米瑞兹^三, Hwei-San Loh公司¹, Kok-Song Lai公司⁴, Chee-Mon Fang先生⁵, 威廉·罗森博格^三, 乔治·罗蒙诺索夫²

附属公司

¹马来西亚塞门耶诺丁汉大学生物科学学院。
²生物化学系，英国诺维奇约翰·因内斯中心。
^三iQur有限公司，英国伦敦。
⁴马来西亚Serdang马来西亚普特拉大学生物技术和生物分子科学学院。
⁵马来西亚塞门耶诺丁汉大学药学院生物医学系。

PMID： 31057572
预防性维修识别码： PMC6477658型
内政部： 10.3389/fpls.2019.00455

摘要

登革热目前被列为最新出现的热带疾病，其原因是全球旅行增加、城市化、卫生条件差以及全球变暖的影响，这些因素促进了登革热的传播伊蚊蚊子超出了它们目前的分布范围。今天，100多个国家受到影响，其中大多数是热带亚洲和拉丁美洲国家，获得医疗服务的机会有限。因此，最终需要开发具有双重成本效益和能够提供全面保护的登革热疫苗。在本研究中，使用抗原登革热病毒糖蛋白结构域III（cEDIII）的一致序列，旨在全面覆盖所有四种循环登革热血清型和潜在的分支替换事件。利用乙型肝炎串联核心技术，将cEDII序列插入免疫显性c/e1环区，以便在组装颗粒的棘突结构上显示。显示cEDIII表位的串联核心颗粒（tHBcAg-cEDIII）在本氏烟草通过农杆菌属-介导的瞬时表达策略，产生约54 kDa的蛋白质，在植物提取物的可溶和不可溶部分中检测到。组装的tHBcAg-cEDIII类病毒颗粒（VLP）也可通过透射电子显微镜观察到。这些VLP的直径从32 nm到35 nm不等，与没有cEDIII显示的tHBcAg对照粒子（即tEL）相比，呈现出明显的尺寸增加。用tHBcAg cEDIII VLPs免疫的小鼠显示出向cEDIII抗原的阳性血清转化，从而表明组装的tHBcAg cEDIII VLPs已成功地向免疫系统显示cEDIII抗原。如果它被证明是成功的，tHBcAg-cEDIII有潜力被开发成为一种成本效益高的候选疫苗，能够同时保护所有四种感染登革热病毒的血清型。

关键词：登革热包膜糖蛋白；登革热疫苗；包膜糖蛋白结构域III；表位显示；乙型肝炎核心抗原；串联核心技术；类病毒颗粒。

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数字

图1
重组载体pEAQ的示意图-*HT（高温）*：：tHBcAg-cEDII。这个*cEDIII公司*基因序列被特异性插入Core II c/el环。pEAQ-*HT（高温）*本研究中使用的载体基于Sainsbury等人（2009），tHBcAg-cEDIII的氨基酸序列如补充材料所示。

图2
tHBcAg-cEDIII蛋白在大肠杆菌中的表达谱*N.本哈米亚纳*6dpi分析，主要以不溶性形式获得。使用抗HBcAg单克隆抗体对约54 kDa大小的tHBcAg-cEDIII蛋白（黑箭头）进行免疫印迹检测。M巷：SeeBlue^®Plus2预存标准；通道1：从pEAQ提取的SP-*HT（高温）*：：tHBcAg-cEDII-过滤叶盘；通道2：从pEAQ提取IP-*HT（高温）*：：tHBcAg cEDIII渗入叶盘；通道3：从pEAQ提取的SP-*HT（高温）*-渗透叶盘；通道4：从pEAQ提取IP-*HT（高温）*-渗透的叶盘。

图3
pEAQ的动力学研究-*HT（高温）*：：tHBcAg-cEDII-过滤*N.本哈米亚纳*.（A）代表性渗透叶的物理外观为1-9dpi。**（B）**用抗HBcAg单克隆抗体进行免疫印迹的相应tHBcAg-cEDIII蛋白（～54 kDa；黑箭头）的表达谱。M巷：SeeBlue^®Plus2预存标准；1-9号车道：从渗出液中提取SPN.本哈米亚纳相应地，从1到9dpi。确定8dpi为可溶性tHBcAg-cEDIII蛋白的适宜收获时间。

图4
pEAQ提取蛋白质的蔗糖缓冲和Nycodenz梯度分离-*HT（高温）*：：tHBcAg-cEDII-滤过的叶子。**（A）**使用抗HBcAg单克隆抗体成功检测到所需tHBcAg-cEDII-VLP（黑箭头）的Western blot图谱。M巷：SeeBlue^®Plus2预染色标准；通道1：净化植物裂解液；车道2：70%蔗糖分数；车道3：界面分数。**（B）**沿着Nycodenz梯度的单一灰色带可以可视化。**（C）**使用抗DENV 1–4单克隆抗体检测Nycodenz梯度组分的Western blot图谱。车道1:60%Nycodenz分数；车道2：50%Nycodenz分数；车道3：40%Nycodenz分数；车道4：30%Nycodenz分数；车道5:20%Nycodenz分数。如黑色箭头所示，成功地从浸润的*N.本哈米亚纳*.

图5
电子显微照片显示纯化的串联核心tHBcAg-cEDIII和tEL VLP用2%（v/v）乙酸铀酰负染。**（A）**tHBcAg-cEDIII VLP以50000倍放大率显示。**（B）**阴性对照tEL VLP在50000倍放大镜下显示。比例尺表示100 nm。带有cEDII表位的嵌合tHBcAg VLP已成功组装成病毒颗粒。

图6
通过ELISA评估BALB/c小鼠中cEDIII特异性IgG抗体反应。**（A）**免疫后4周和9周，小鼠血清在1:100至1:3200稀释液中的cEDIII特异性IgG抗体水平。**（B）**免疫后4周和9周小鼠抗体反应的比较，以1:100的稀释度通过ELISA测试。条形代表平均值的平均值±标准误差，图表代表两个独立的动物免疫实验(n个= 2). 学生的t吨-测试用于确定显著性水平(第页≤0.001表示为^∗∗和第页≤0.0001表示为^∗∗∗). 请注意一表示接受cEDII（阳性对照）的小鼠与空VLP（tEL；阴性对照）免疫组之间的比较；b条表示tHBcAg-cEDIII和tEL VLP之间的比较*c（c）*表示cEDIII和tHBcAg-cEDIII组之间的比较。

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