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.2019年4月30日；27（5）：1541-1550.e5。
doi:10.1016/j.celrep.2019.04.033。

线粒体钙的综合遗传特性2+Uniporter组分揭示其体内不同的生理需求

罗伯塔·图菲 1, 托马斯·格里森 1, 索菲亚·冯·斯托克姆 2, 维多利亚·L·休伊特 1, 朱丽叶·J·李 1, 安娜·特里恩特·费利克斯 1, 阿尔瓦罗·桑切斯·马丁内斯 1, 埃琳娜·齐维亚尼 2, 亚历山大·惠特沃思 三
附属公司

线粒体钙的综合遗传特性2+Uniporter组分揭示其体内不同的生理需求

罗伯塔·图菲等。 单元格代表. .

摘要

线粒体钙2+摄取是新陈代谢和细胞死亡的重要介质。高度保守的线粒体Ca组分的鉴定2+uniporter已将其用于模式生物的遗传分析。在这里，我们报告了果蝇中保存的所有已知单转运蛋白成分的综合遗传特征。而孔形成MCU或EMRE的缺失会快速消除线粒体Ca2+尽管寿命缩短，但这在年轻时只会导致轻微的表型。相比之下，失去MICU1门卫对发育是致命的，这与未调节的钙一致2+吸收。神经限制性调节因子MICU3的突变对轻度神经损伤是可行的。遗传相互作用分析表明，MICU1和MICU3在功能上不可互换。更令人惊讶的是，MCU或EMRE的缺失并没有抑制MICU1突变的致死性，这表明这是由非单转运蛋白独立功能引起的。我们的数据揭示了线粒体钙组分之间的相互作用2+uniporter和阐明了它们在体内的生理需求。

关键词：果蝇；EMRE；单片机；MICU1；MICU3；钙；遗传互作；遗传学；线粒体。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
这个MCU（微控制器）1突变体消除快速线粒体钙2+尽管存在呼吸缺陷，但在不影响生物体表型的情况下吸收和缩短寿命（A）MCU（微控制器）（CG18769）5′基因区域（来自FlyBase），包括相邻的超临界流体(无硫酸盐的). P{EPgy2}EY08610用于生成的转置元素MCU（微控制器）1显示，以及MCU（微控制器）1断点。（B） 蛋白质印迹分析MCU（微控制器）1用所示抗体进行免疫印迹检测。星号表示非特定带。线粒体ATP5A用作负荷控制。（C） 钙的代表性痕迹2+添加45μM CaCl后，从指示基因型的成虫分离的线粒体中的摄取2.线粒体外钙2+用钙绿-5N荧光测定。钙2+通过添加1μM FCCP从线粒体中释放。添加MCU抑制剂钌红（RuR；2μM）阻断线粒体钙2+吸收，这反映在MCU（微控制器）1.线粒体钙2+通过转基因重新表达MCU（微控制器）由驱动da-GAL4号机组（D）通过钙初始相的线性拟合，确定（C）中所示痕量的相对吸收动力学2+摄入并归一化为野生型对照（平均值±SEM，n=3）。（E） 寿命曲线MCU（微控制器）1雄性苍蝇与对照和转基因拯救的比较(MCU（微控制器）1 +MCU（微控制器）)由驱动da-GAL4号机组统计分析：Mantel-Cox对数秩检验（n≥80）。（F） 对照爬升试验（精确的切除回复物，MCU（微控制器）车辆)和MCU（微控制器）1果蝇羽化后2天和20天。通过Kruskal-Wallis检验和Dunn的事后校正来测量多重比较的显著性（平均值±95%置信区间（CI）；n>70；∗p<0.05；ns，不显著）。（G） 来自控制和MCU（微控制器）1苍蝇。统计分析：未配对t检验（平均值±SD；n=2-3；∗∗∗∗p<0.0001；ns，不显著）。（H） 对照组和对照组的耗氧量（OCR）MCU（微控制器）1羽化后3天和20天飞行。统计分析：未配对t检验（平均值±SEM；n=3；∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001）。对照基因型为周1118除非另有说明。另请参见图S1和S2。
图2
图2
EMRE公司突变体无快速线粒体钙2+摄入和寿命短但有轻度表型（A）野生型和EMRE公司突变体，具有预测的蛋白质序列和gRNA识别位点的位置（彩色文本）。方框表示英国广播公司I解理位点。（B） 的相对表达式EMRE公司对照和EMRE公司1突变体（平均值±标准差；n=3）。（C） 钙的代表性痕迹2+添加45μM CaCl后，从指示基因型的成虫分离的线粒体中的摄取2.线粒体外钙2+用钙绿-5N荧光测定。钙2+通过添加1μM FCCP从线粒体中释放。EMRE公司突变阻止线粒体钙2+吸收相当于抑制剂钌红（RuR；2μM）。（D） 通过钙的线性拟合确定相对摄取动力学2+摄取痕迹并归一化为对照（平均值±SEM；n=3）。（E） 的寿命曲线EMRE公司1雄性苍蝇与对照组相比。统计分析：Mantel-Cox log-rank检验（n≥91）。（F） 来自控制和EMRE公司1苍蝇。统计分析：未配对t检验（平均值±SD；n=3；ns，无显著性）。（G） 对照组耗氧量（OCR）和EMRE公司1羽化后3天和20天飞行。统计分析：未配对t检验（平均值±SEM；n=3；∗p<0.05）。对照基因型为周1118在所有情况下。另请参见图S3。
图3
图3
MICU1系列32突变株致命，ATP和线粒体运输减少，无法通过MCU（微控制器）1或EMRE公司1（A） 概述MICU1系列（CG4495）基因区域（来自FlyBase）。P{SUPor-P}话筒1KG04119公司用于生成的转置元素MICU1系列32显示，以及中删除的区域MICU1系列32.（B）的相对表达MICU1系列控制记录和MICU1系列32幼虫（平均值±SD；n=3）。（C） 幼虫爬行控制和MICU1系列32幼虫，表示为每分钟蠕动波的数量。统计分析：未配对t检验（平均值±95%CI；n=10；∗∗p=0.0034）。（D） 来自控制和MICU1系列32幼虫。统计分析：未配对t检验（平均值±SD；n=4；∗∗p=0.0011）。（E） （F）所示图像中线粒体密度的量化（缩放图像）。统计分析：单因素方差分析（平均值±标准差；n=4；∗p<0.05；ns，不显著）。（F） 对照组和对照组表皮细胞的共焦显微镜分析MICU1系列32用线粒体标记物抗ATP5A对幼虫进行免疫染色。方框区域向右放大。比例尺：10μm（左），4μm（右）。（G） 对照组和对照组线粒体轴突转运的典型波形图MICU1系列32幼虫。比例尺：10μm（水平），50 s（垂直）。基因型对照：M12-GAL4，UAS-mito-HA-GFP/+。MICU1系列32：微型计算机132/MICU1系列32; M12-GAL4，UAS-mito-HA-GFP/+（H）线粒体转运的量化如（G）所示。统计分析：单因素方差分析（平均值±95%置信区间；n=6（对照）和11（突变）；∗∗p<0.01，∗∗∗∗p<0.0001；ns，不显著）。（一） 的生存能力表MICU1系列32通过转基因表达拯救MICU1系列或MICU3系列同种型或丢失MCU（微控制器）或EMRE公司.使用普遍存在的驱动因子诱导转基因表达：GAL4臂对于MICU1系列和da-GAL4号机组对于MICU3系列.（J）对照苍蝇攀爬试验(GAL4臂/+)和MICU1系列32无处不在的突变体(GAL4臂)驱动HA标记的MICU1-A和MICU1-B亚型的转基因再表达。统计分析：采用Kruskal-Wallis检验和Dunn事后校正进行多重比较（平均值±95%CI；n≥40）。对照基因型为周1118除非另有说明。
图4
图4
MICU3系列功能丧失在很大程度上是有利的（A）MICU3系列（CG4662）基因区域（来自FlyBase），包括gRNA识别位点的位置。（B） 野生型和MICU3系列27，具有相对预测的蛋白质序列。gRNA识别位点以红色突出显示。方框表示MboII裂解位点。（C） 的相对表达式MICU3系列控制记录和MICU3系列27苍蝇（平均值±SD；n=3）。（D） 寿命曲线MICU3系列27雄性苍蝇与对照组相比。统计分析：Mantel-Cox log-rank检验（n≥84）。（E） 对照组耗氧量（OCR）和MICU3系列27羽化后第3天和第20天飞行。统计分析：未配对t检验（平均值±SEM；n=4）。对照基因型为周1118在所有情况下。另请参见图S4。
图5
图5
过度表达的Uniporter组分的遗传相互作用（A）眼睛特异性苍蝇GMR-GAL4公司驾驶员和UAS-MCU公司转基因（GMR>MCU）与指定单转运蛋白组分的转基因或对照（+）杂交周1118行。（B） 具有眼睛特异性组合的苍蝇GMR-GAL4公司驾驶员和两者UAS-MCU和UAS-EMRE公司转基因（GMR>MCU+EMRE）与指定成分的转基因或对照（GFP）转基因杂交。在显微图像下方是基于过度表达成分的单脚架拟议状态示意图。比例尺：100μm。另请参见图S5。
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