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.2019年4月30日；10(1):1981.
doi:10.1038/s41467-019-09852-0。

肝靶向纳米技术促进小檗碱改善心血管疾病

郭慧慧 1, 陈林峰 1, 张文宣 1, 志刚罗 1, 张洪娟 1, 张婷婷 1, 陈马 1, 云战 1, 芮莉（Rui Li） 1, 宋武 1, Zeper Abliz公司 1, 丛莉 1, 李小林 1, 马晓雷 1, 王璐璐 2, 郑文生 三, 颜兴涵 4, 江建东 5
附属公司

肝靶向纳米技术促进小檗碱改善心血管疾病

郭慧慧等。 国家公社. .

摘要

心血管和代谢疾病（CMD）仍然是世界范围内早死的主要原因。小檗碱（BBR）是一种降脂植物化合物，具有多种抗代谢紊乱的功效，是改善CMD的理想候选药物。肝脏是BBR的靶点，因此肝脏的蓄积对于实现其治疗效果至关重要。本研究开发了一种合理设计的胶束（CTA-Mic），由α-生育酚疏水核和现场可分离的聚乙二醇-硫醇壳组成，用于BBR在肝脏的有效沉积。生物分布分析证明，在胶束的辅助下，BBR在肝内的蓄积量增加了248.8%。在HepG2细胞和体内可检测到一系列能量相关基因的上调。在高脂肪饮食小鼠中，BBR-CTA-Mic干预显著改善代谢状况并减少主动脉弓斑块的形成。我们的研究结果为使用纳米技术促进的天然药物改善CMD的肝脏靶向策略提供了概念证明。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
TPGTSA和BBR-CTA-Mic的表征。一TPGTSA的物理特性。左：核磁共振氢谱(1核磁共振氢谱）；中间：傅里叶变换红外光谱（FTIR）；右图：基质辅助激光解吸/电离时间质谱（MALDI-TOF-MS）。b条空CTA-Mics（向上）和BBR-CTA-Mic（向下）的粒度、Zeta电位和形态。c（c）药物释放研究。采用透析法从BBR-CTA-Mic和BBR-TPGS-Mic中释放BBR。对照组为BBR-S。0.4 将mL BBR-S或含BBR的麦克风密封在透析袋中并浸没在50中 mL空腹状态模拟胃液（SGF，pH 1.6），空腹状态仿真肠液（SIF，5 胆汁盐mM，pH 6.8），模拟血清（SS，20%FBS白蛋白，pH 7.4）和模拟肝环境（20%小鼠肝匀浆）。数据以平均值表示 ± 扫描电镜(n个 = 5).d日BBR制剂在Caco-2细胞系中的跨上皮转运研究。Up：含BBR配方的双向表观跨上皮渗透率（Papp）以及CsA对不同样品传输的影响；向下：不同含BBR配方对Rho123运输的影响。数据以平均值表示 ± 扫描电镜(n个 = 6), *第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，与未经治疗的对照组相比，第页-值由未配对的双边学生t吨-测试。比例尺，100 纳米(b条)
图2
图2
细胞内吸收分析。一。用各种BBR制剂处理细胞，其等效BBR浓度为1 μg 毫升−1用于3 h、 分别为37岁 °C，含5%CO2左：使用CLSM（德国卡尔蔡司）可视化HepG2细胞BBR的代表性荧光图像；右图：HepG2细胞BBR的代表性流式细胞术图。b条用BBR-S或BBR-CTA-Mic处理细胞1、4或8 h、 分别是。使用CLSM可视化HepG2细胞BBR的典型荧光图像。c（c）HepG2细胞预先用BBR-S或BBR-CTA-Mic与P-gp siRNA或错配siRNA（mm RNA）（50 nM）适用于8 h.用PBS冲洗细胞两次，然后用新鲜培养基培养4次 h.左：使用C2t尼康荧光显微镜显示HepG2细胞中BBR和P-gp的代表性荧光图像（Morrell，美国）；中间：驱散实验前后HepG2细胞BBR沉积的代表性流式细胞术图。右：RNAi前后HepG2细胞P-gp表达的代表性流式细胞术图。实验分五次进行。比例尺，10 μm(一–c（c）)
图3
图3
生物分布评估。向C57BL/6J小鼠注射BBR-S或BBR-CTA-Mic（50 毫克 公斤−1BBR）通过灌胃注射。一在每个预定的时间点，每种配方的五只小鼠被安乐死，血液（0.5 mL）从眼眶后静脉丛至肝素化管，采集主要器官（心、肝、脾、肺和肾）。在激发/发射时，使用IVIS成像系统对主要器官进行成像n个 = 465/540 纳米。（心、肝、脾、肺和肾，从左到右）。b条通过LC/MS/MS实现对C57BL/6J小鼠不同时间点BBR分布的定量分析(n个 = 5，平均值 ± SEM）。采用活体聚焦评价法进一步检测BBR-S或BBR-CTA-Mic组的肝细胞BBR蓄积。肝脏样品的冷冻切片是通过将肝脏组织切成4块来制备的 微米。c（c）使用CLSM LSM710（德国卡尔蔡司）Ex观察BBR的肝细胞聚集 = 365 纳米；相对长度单位 = 480 纳米。d日采用环境质谱成像方法检测BBR在肝脏的蓄积。实验在配备Q-Orbitrap质谱仪的气流辅助解吸电喷雾电离（AFADESI）-MSI平台上进行。比例尺，50 μm(c（c）)
图4
图4
体外药理作用。HepG2细胞用各种BBR制剂处理，其等效BBR浓度为1 μg 毫升−1用于8 37小时 °C，含5%CO2.一归纳第页-用抗InsR、LDLR和第页-AMPK抗体，用C2t尼康荧光显微镜观察（莫雷尔，美国）。b条mRNA表达AMPK公司,InsR公司,AKT公司，以及低密度脂蛋白受体基因通过RT-PCR进行评估。将结果归一化为GAPDH。c（c）AMPK的蛋白表达，第页-AMPK、InsR、，第页-InsR、AKT、，第页-用western blot分析检测AKT和LDLR。结果作为密度比归一化为GAPDH。数据以平均值表示 ± 扫描电镜(n个 = 6), *第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，与NC组相比，第页-数值通过不成对的双侧Student’s计算t吨-测试。比例尺，100 μm(一)
图5
图5
体内药效学。C57BL/6J小鼠喂HFD 8周，然后随机分为4组：模型对照组（MC）、BBR-S组（BS，50 毫克 公斤−1BBR的）、空胶束基团（EM，与BBR胶束相同）或BBR-CTA胶束基团（BM，50 毫克 公斤−1BBR），同时通过灌胃方式再次出现HFD 8周。以喂食标准啮齿动物饲料（NC）的未处理小鼠作为对照。一代表性照片第页-使用C2t尼康荧光显微镜（美国莫雷尔），通过抗InsR、LDLR和第页-AMPK抗体同时出现。b条mRNA表达AMPK公司,InsR公司,AKT公司，以及低密度脂蛋白受体基因通过RT-PCR进行评估。将结果归一化为GAPDH。c（c）AMPK的蛋白表达，第页-AMPK、InsR、，第页-InsR、AKT、，第页-用western blot分析检测AKT和LDLR。结果作为密度比归一化为GAPDH。数据以平均值表示 ± 扫描电镜(n个 = 10), *第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，与MC组小鼠相比；#第页 < 0.05,##第页 < 0.01,###第页 < 0.001，与EM组小鼠相比，第页-值由未配对的双边学生t吨-测试。比例尺，200 μm(一)
图6
图6
体内高脂血症、体重和肥胖分析。喂食HFD的C57BL/6J小鼠用各种BBR制剂灌胃治疗。以喂食HFD（MC组）和标准食物（NC组）的未处理小鼠作为对照。一生化分析。血浆TG、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、葡萄糖和肝脏TG用自动生化分析仪用酶法测定。b条全身、肠系膜和附睾脂肪、肝组织和脂肪细胞大小变化的代表性图片和重量变化。数据以平均值表示 ± 扫描电镜(n个 = 10), *第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001,与MC组小鼠；#第页 < 0.05,##第页 < 0.01,###第页 < 0.001与EM组小鼠相比，第页-值由未配对的双边学生t吨-测试。比例尺，100 μm(b条)
图7
图7
脂肪肝和肝损伤评估。喂食HFD的C57BL/6J小鼠用不同BBR制剂灌胃治疗(n个 = 每组10个）。喂食HFD或标准食物的未处理小鼠（NC组）作为对照。一HE染色肝脏切片的代表性照片。插图包含整个肝组织切片的图像。感兴趣区域（ROI）以白色方框显示，其放大图像显示在右侧。b条油红O染色肝脏切片的代表性照片。感兴趣区域（ROI）以白色方框显示，其放大图像显示在右侧
图8
图8
炎症状况分析。喂食HFD的C57BL/6J小鼠，用不同BBR制剂灌胃治疗。一血浆中促炎细胞因子水平。实验结束后，收集血样，并根据制造商的指示，使用490℃的照度计，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血浆TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17、MCP-1、MMP-9和IFNγ水平 纳米。采集附睾脂肪和肝脏组织。b条免疫荧光染色肝组织IL-6（红色）和TNF-α（绿色）的代表性照片，使用C2t尼康荧光显微镜进行可视化（莫雷尔，美国）。感兴趣区域（ROI）以白色方框显示，其放大图像显示在底部。c（c）使用C2t尼康荧光显微镜（美国莫雷尔）观察免疫荧光染色脂肪组织IL-6（红色）和TNF-a（绿色）的代表性照片。感兴趣区域（ROI）以白色方框显示，其放大图像显示在底部。d日western blot检测肝组织（上）和脂肪（下）中IL-6和TNF-α的蛋白表达。e采用RT-PCR检测肝组织（左侧）和脂肪组织（右侧）IL-6和TNF-αmRNA的表达。数据以平均值表示 ± 扫描电镜(n个 = 10). *第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001,与MC组小鼠；#第页 < 0.05,##第页 < 0.01,###第页 < 0.001，与EM组小鼠相比，第页值由未配对的双边学生t吨-测试。比例尺，200 μm(b条,c（c）左下角）和20 μm(b条,c（c），右上）
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