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.2019年7月；9(7):944-961.
doi:10.1158/2159-8290.CD-18-1393。 Epub 2019年4月30日。

高剂量烷化剂诱导淋巴瘤清除的机制

陈洛索斯 1, 刘云鹏 2 三, 凯利·科尔布 2 4 5, 阿曼达·L·克里斯蒂 1, 亚历山大·范·斯科克 1, 桑杰·M·普拉卡丹 2 4 5, 凯·希格莫里 1, 克里斯汀·史蒂文森 1, 萨拉·莫罗 1, 奥利维亚·D·普拉纳 1, 卡梅隆·弗雷泽 6 7, 克里斯汀·琼斯 1, 刘慧云 1, 克里斯蒂安·帕拉什 8, 丽贝卡·莫迪斯特 9, 广德阮 9, 杰弗里·克雷格 10, 伊丽莎白·A·摩根 10, 弗朗西斯科·维加 11 12, 乔恩·C·阿斯特 10, 克里斯托弗·萨罗西克 6 7, 亚历克斯·K·沙利克 2 4 5, 迈克尔·T·赫曼 2 三, 大卫·M·温斯托克 13 2
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高剂量烷化剂诱导淋巴瘤清除的机制

陈洛索斯等。 癌症发现. 2019年7月.

摘要

近60年前，人们描述了高剂量环磷酰胺对一些高级淋巴瘤的非凡活性。在这里，我们探讨了在真正的人类双发淋巴瘤中调节环磷酰胺活性的机制。我们发现骨髓（BM）内的抗体抵抗在早期植入时不存在，但在淋巴瘤进展过程中发展。这种耐药性需要较高的肿瘤与巨噬细胞比率，通过部分巨噬细胞耗竭在脾脏中进行重新组合，并通过多种高剂量烷基化剂加以克服。环磷酰胺诱导BM-淋巴瘤细胞内质网应激体内这导致ATF4介导的VEGFA旁分泌、大量巨噬细胞浸润和阿仑单抗调理细胞的清除。环磷酰胺治疗后分离出的BM巨噬细胞的吞噬能力增加，而VEGFA阻断或SYK抑制可逆转这种情况。这些巨噬细胞的单细胞RNA测序确定了一个表达CD36/FCGR4的“超吞噬细胞”亚群。总之，这些发现定义了一种新的机制，高剂量烷基化剂通过该机制促进巨噬细胞依赖性淋巴瘤的清除。意义：单克隆抗体仅对一小部分癌症有效。在此，我们重述了室特异性抗体抵抗，并定义了高剂量烷基化剂诱导的内质网应激依赖机制，该机制可促进调理肿瘤细胞的吞噬。这种方法与单克隆抗体产生协同效应，值得在其他肿瘤类型中进行测试。见Duval和De Palma的相关评论，第834页.这篇文章在《in This Issue》专题文章中有重点介绍，第813页.

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利益声明：提交人声明没有相关的利益冲突。

数字

图1：
图1:。烷化剂克服骨髓抗体耐药性
（A） 流式细胞术分析DFBL-20954和DFBL-69487表面CD20和CD52的表达。（B） 在治疗的第8天，从用PBS、环磷酰胺（CTX）、阿霉素（Doxorubicin，Dox）或阿莱姆（Alem）或其组合治疗的小鼠中获取脾脏，并冲洗单个股骨，如图所示。对总细胞进行计数并分析所示标记。存在的肿瘤细胞总数表示为活细胞总数*的产物（7-AAD−)hCD19/hCD45双阳性细胞。BM肿瘤负担表示为每根股骨的平均肿瘤细胞数。双边韦尔奇的所有比较t吨-测试，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。（C）18注射后第21天（左侧）和Alem治疗后48小时（右侧）植入DFBL-20954的小鼠的FDG-PET成像显示骨髓（如股骨和胫骨）疾病进展，但淋巴结区域（如腋下）疾病消退。（D） 经PBS、CTX、Alem或CTX+Alem处理的移植DFBL-20954和DFBL-69487的NSG小鼠总生存率的Kaplan-Meier曲线。p<0.0001 CTX vs Veh，p<0.001 CTX+Alem vs 20954的CTX，p<0.01 CTX+Allm vs 69487的CTX；p<0.001CTX+Alm vs CTX，两者均为p<0.001。所有比较均采用log-rank检验。（E） 移植DFBL-20954并用PBS、Alem、CTX、异环磷酰胺（ifos）、白消安（bu）或纳维托克劳治疗的NSG小鼠的骨髓肿瘤负荷。如（B）所示，从一根股骨评估肿瘤总负荷。双边韦尔奇的所有比较t吨-测试。
图2：
图2:。骨髓对阿仑单抗的耐药性与微环境重塑
（A） 1×106将DFBL-20954细胞注射到NSG小鼠中，并在指定的第8、12和16天（蓝色箭头的底部）开始Alem治疗（每日x 2）。蓝色箭头的尖端对应于第二次治疗剂量后48小时用Alem治疗的小鼠的肿瘤负担。N=每个时间点每种情况下3只小鼠。（B） DFBL-20954淋巴瘤细胞的检测体内APC结合Alem治疗。显示了具有代表性的流式细胞仪图。（C） 移植1×10后第10天6DFBL-20954细胞，用氯膦酸盐脂质体（clod，200ul）或PBS处理小鼠。在第12天静脉注射10mg/kg的Alem（Alem）单剂量。治疗48小时后评估肿瘤负担。双面韦尔奇t吨-测试，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。（D） 移植10只后第19天6DFBL-20954细胞，小鼠接受氯膦酸盐或PBS（−）。在第21天，小鼠接受CTX、Alem（10mg/kg静脉注射单剂量）、联合或载体（PBS），并在第23天评估肿瘤负担。用台盼蓝染色法检测小鼠细胞的数量和存活率。肿瘤负担是指活肿瘤细胞的数量。双面韦尔奇t吨-测试。（E） 主要、可行BM（7-AAD−人CD19−CD11b型+80层/四层+)从未移植或淋巴移植NSG小鼠中分离单核细胞/巨噬细胞。来自相应移植小鼠或Raji细胞的骨髓肿瘤细胞在Alem存在或不存在的情况下进行培养。在相同条件下（每个条件n=3），未接枝和载体之间的所有比较都不显著。（F） 原发性活脾（7AAD−人CD19−CD11b型−80层/四层+)和BM（hCD19−CD11b型+80层/四层+)从未移植或淋巴移植的NSG小鼠中分离单核细胞/巨噬细胞，并与来自相应异种移植治疗的BM淋巴瘤细胞一起培养体外和Alem一起。在相同条件下（每种条件3个），脾脏和骨髓巨噬细胞之间的所有比较均无显著性。（G） 淋巴瘤比率（hCD19+人CD45+)巨噬细胞（hCD19−CD11b型−80层/四层+)DFBL-20954移植小鼠化疗启动48小时后的细胞。双面韦尔奇t吨-测试，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。Dox vs CTX BM不显著（H）小鼠植入DFBL-20954，并在第19天给予氯膦酸盐（25ul）或溶媒，然后在第21天和第22天给予Alem或溶媒并在给药后48小时处死。显示脾脏肿瘤负担。双面韦尔奇t吨-测试，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。（一） 巨噬细胞BM（hCD19−CD11b型+80层/四层+)所示药物启动8天后基于流式细胞术的细胞数。双面韦尔奇t吨-测试，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。两种异种移植物PBS与CTX的比较。在所有条件下，CTX与Dox的比较均显著（DFBL-20954的p<0.001，DFBL-69487的p<0.05）。（J） 植入DFBL-20954或DFBL-69487的小鼠固定股骨的代表性抗F4/80染色（棕色），并在使用指定药物治疗40小时后收获。图像按指示放大1倍和20倍。
图3：
图3:。环磷酰胺促进巨噬细胞吞噬淋巴瘤
（A） 在用PBS、阿霉素（Dox）或环磷酰胺（CTX）治疗16小时后，通过去除小鼠细胞，从植入DFBL-20954的小鼠（n=3/条件）的脾脏和骨髓中分离出肿瘤细胞。去除死细胞，培养剩余的活肿瘤细胞体外在有无Alem（Alem）的情况下，骨髓源性巨噬细胞。双面韦尔奇t吨-试验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001（B）DFBL-20954移植小鼠骨髓和脾脏中指示蛋白的平均荧光强度（MFI）表面表达与同型对照或ELISA总蛋白水平的比较（n=3-6每种情况）。成对双面t吨-测试。（C） 从未经治疗的小鼠骨髓中分离出DFBL-20954细胞（N=3只小鼠），用CFSE标记，并与骨髓来源的巨噬细胞在有或无Alem和前列腺素E2（PGE2，2ng/ml）的情况下共同培养。吞噬作用被量化为CD11b的百分比+CFSE细胞+实验进行了三次，并显示了一个代表性的例子。（D） 如（C）所示，但含有重组人半乳糖凝集素-1（Gal-1500 ng/ml）和乳糖（20 mM）。（E） 将DFBL-20954移植小鼠（每种情况3-6只）用指示的药物进行治疗，并检测指示标记在活肿瘤细胞上的表面表达。治疗后16小时对CD47和VISTA进行量化；治疗后48小时CD52和钙网蛋白。治疗48小时后通过ELISA定量PGE2和Gal-1水平。
图4：
图4:。环磷酰胺诱导DHL分泌VEGF-A和IL-16促进肿瘤清除
（A） 从未经治疗的小鼠骨髓中分离出DFBL-20954细胞，用CFSE标记，并与骨髓来源的巨噬细胞和按指示治疗的小鼠条件培养基（每种情况3个）共同培养。MC=媒体控制。Alem特异性杀伤被定义为CFSE的百分比增加+巨噬细胞在Alem存在下与无抗体相比。未配对双面-t吨-试验，**p<0.01，***p<0.001（B）16小时后收集的DFBL-20954移植小鼠骨髓中人VEGF-A和IL-16的水平体内用溶媒（−）、阿霉素（Dox）或环磷酰胺（CTX）治疗。显示了具有代表性的实验。相同细胞因子阵列的小鼠VEGF-A水平<1 pg/ml-t吨-测试，*p<0.05，**p<0.01。（C） BMDM与CFSE标记的BM淋巴瘤细胞（N=3只小鼠）孵育，这些细胞来自补充了Alem、重组人VEGF-A或载体（−）的未经治疗的小鼠。实验进行了≥2次，并给出了代表性示例。吞噬作用被评估为CD11b的百分比+CFSE细胞+.双面韦尔奇t吨-试验，*p<0.05。（D） BMDM与来自未经治疗小鼠的CFSE标记的BM淋巴瘤细胞和条件培养基（每种条件下3只小鼠）孵育，条件培养基补充有载体（−）、Alem、重组Gal-1（1¼g/ml）、PGE2（5 ng/ml）和/或贝伐单抗（bev，30¼g/ml）。未配对双面-t吨-测试。（E） DFBL-20954移植小鼠在用所述药剂治疗后第8天的骨髓肿瘤负荷。双面韦尔奇t吨-测试。（F） BMDM与GFP孵育+Raji细胞和重组人VEGF-A（10ng/ml）。实验进行了三次，并给出了一个典型的例子。如图所示，添加SYK抑制剂BAY61-3606（20 nM）。吞噬作用被评估为CD11b的百分比+GFP细胞+.未配对双面-t吨-测试。
图5：
图5:。环磷酰胺诱导DHL细胞分泌细胞因子的内质网应激
（A） 对从脾脏或骨髓中采集的DFBL-20954细胞的RNA序列进行ER-stress特征的基因富集分析（GSEA）。该比较反映了与PBS治疗相比，环磷酰胺（CTX）治疗后基因过度表达。P值具有错误发现率（FDR）调整。缩写：ES，浓缩分数；NES，标准化浓缩分数。（B） 使用16小时后收集的纯化、活的BM DFBL-20954细胞的裂解物对指示靶点进行免疫印迹体内使用PBS（载体）、阿霉素（Dox）或CTX治疗。每条通道代表一只单独的鼠标。（C） 人VEGF-A在从骨髓中分离并经处理的DFBL-20954细胞（左）或培养基（右）中的水平体外使用二甲基亚砜（DMSO）、他吡加金（TG）或衣霉素（TM）治疗24小时。双面韦尔奇t吨-测试*p<0.05，**p<0.01。（D） 16小时后从整个BM中采集的人类VEGF-A水平体内治疗DFBL-20954移植小鼠。未配对双面-t吨-测试。（E） 免疫印迹法，如人类ATF4外显子1定位的（B）（F）ChIP-qPCR血管内皮生长因子-A或人类第7外显子ASNS公司在用Veh、Dox或CTX处理后16和48小时分别收集的纯化、活的BM DFBL-20954和DFBL-69487细胞中（n=3个重复，每个重复合并多只小鼠）。未配对双面-t吨-测试。
图6：
图6:。环磷酰胺在淋巴瘤移植骨髓中诱导超吞噬细胞巨噬细胞。
（A） 原发性活脾（7AAD−人CD19−CD11b型−80层/四层+)和BM（7AAD−人CD19−CD11b型+80层/四层+)从用PBS（Veh）、阿霉素（dox）或环磷酰胺（CTX）处理并在GFP存在下培养的未移植或携带DFBL-20954的NSG小鼠（每种情况3只）中分离单核细胞/巨噬细胞+用Alem预处理的Raji细胞。双面韦尔奇t吨-测试**p<0.01。（B） 骨髓巨噬细胞RNA-seq的多维标度（MDS）分析，比较未移植（WT）或淋巴移植（DFBL-69487=1，DFBL-20954=2）小鼠与PBS（V）、Dox（D）、Ctx（C）、Alem（Alem）或Ctx+Alem（combo）治疗的小鼠。治疗48小时后采集巨噬细胞。（C） PBS、dox或CTX治疗的未移植（unreg）或移植小鼠BM巨噬细胞的单细胞RNA-seq的t-SNE图显示六个簇（左）。集群4富含来自CTX治疗的淋巴移植小鼠的巨噬细胞。图图例中显示了每个治疗组的聚类和每个聚类中的数字。（D） 分选BM巨噬细胞的单细胞RNA-seq中Fc-γ受体的表达如（C）所示。（E） 未移植或DFBL-29054移植小鼠巨噬细胞Fcγ受体表达的流式细胞术分析体内如图所示。治疗48小时后收集巨噬细胞。热图表示归一化为同型对照的MFI的Z分数。（F） 从经PBS或CTX处理的DFBL-29054移植小鼠中收集的BM巨噬细胞的代表性流式细胞术。未配对双面-t吨-试验（G）将来自（F）的巨噬细胞按指示分类或未分类（散装），用CFSE标记，并暴露于经PBS或CTX预处理的小鼠的BM DFBL-20954细胞体外Alem组（每种情况5只小鼠）。未配对双面-t吨-测试，*p<0.05，**p<0.01
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