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.2019年2月28日；9(6):1614-1633.
doi:10.7150/thno.30398。 2019年eCollection。

SIRT3依赖性线粒体动力学重塑与氧化应激诱导的白癜风黑素细胞变性

伊秀丽 1, 渭南郭 1, 琼石 1, 杨宇奇 1, 张伟刚 1, 陈旭光 1, 潘康 1, 陈嘉熙 1, 崔婷婷 1, 马金源 1, 王慧娜（Huina Wang） 1, 郭森 1, Yuqian Chang公司 1, 刘玲（Ling Liu） 1, 哲坚 1, 王林（Lin Wang） 1, 钱晓 1, 李淑丽 1, 天闻高 1, 李春英 1
附属公司

SIRT3依赖性线粒体动力学重塑与氧化应激诱导的白癜风黑素细胞变性

伊秀丽等。 治疗诊断科技. .

摘要

线粒体失调与氧化应激诱导的白癜风黑素细胞破坏有关。然而，这个过程背后的分子机制仅仅是研究。鉴于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的重要作用+)-依赖性脱乙酰酶Sirtuin3（SIRT3）维持线粒体动力学和内环境稳定，SIRT3的表达和活性可能受到氧化应激相关信号的影响，我们想知道SIRT3是否可以通过调节线粒体动力学在白癜风黑素细胞变性中发挥重要作用。方法：我们最初通过PCR、免疫印迹和免疫荧光分析证实SIRT3在正常和白癜风黑素细胞中的表达和活性。然后，通过流式细胞术、免疫印迹、激光共聚焦显微镜、透射电镜和牛痘活性测定分析SIRT3干预后的细胞凋亡、线粒体功能和线粒体动力学。通过染色质免疫沉淀（ChIP）、协同免疫沉淀（co-IP）、免疫印迹和免疫荧光分析来阐明SIRT3的上游调控机制。最后，通过流式细胞术和免疫印迹分析研究和厚朴酚对黑素细胞的保护作用及其机制。结果：我们首先发现SIRT3在白癜风黑素细胞中的表达和活性均显著受损在体外和体内然后，SIRT3缺陷通过诱导严重的线粒体功能障碍和细胞色素c释放到细胞质导致更多的黑素细胞凋亡，而视神经萎缩1（OPA1）介导的线粒体动力学重塑参与其中。此外，增强的羰基化和抑制的过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活物1-alpha（PGC1α）激活是白癜风黑素细胞SIRT3失调的原因。最后，我们证明和厚朴酚可以通过激活SIRT3-OPA1轴来阻止氧化应激下黑素细胞的凋亡。结论：总的来说，我们证明SIRT3依赖的线粒体动力学重构有助于氧化应激诱导白癜风黑素细胞变性，和厚朴酚有望预防氧化应激诱导的白癜风黑素细胞凋亡。

关键词：SIRT3；细胞凋亡；黑素细胞；线粒体动力学；白癜风。

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利益冲突声明

竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
图1
氧化应激下白癜风黑素细胞SIRT3表达和活性受损。（A） 1.0 mM H处理后PIG1和PIG3V细胞SIRT3的相对mRNA水平2O（运行）224 h。数据表示平均值±SD（n=3）。（B） 1.0 mM H后PIG1和PIG3V细胞SIRT3蛋白水平2O（运行）2治疗。检测β-肌动蛋白作为负荷对照。数据表示平均值±SD（n=3）。（C） 1.0 mM H后PIG1和PIG3V细胞SIRT3表达的免疫荧光染色分析2O（运行）2处理后，用DAPI（蓝色）对细胞核进行复染。数据代表了三个独立执行的实验。比例尺=50μm（放大倍数：600×）。使用Image J软件定量黑素细胞中SIRT3信号的强度。（D） 1.0 mM H后PIG1和PIG3V细胞中的SIRT3活性2O（运行）2治疗。数据表示平均值±SD（n=3）。（E） H后PIG1和PIG3V细胞线粒体蛋白的乙酰化2O（运行）2治疗。TOMM20被检测为加载控制。数据表示平均值±SD（n=3）。（F） 1.0 mM H后PIG1和PIG3V细胞中SOD2的乙酰化2O（运行）2以β-肌动蛋白作为负荷对照。数据表示平均值±SD（n=3）。p值由双尾Student计算t吨-测试。*p＜0.05，**p<0.01，***p<0.001，NS，无显著性。
图2
图2
白癜风周围皮肤黑素细胞SIRT3表达和活性受损。（A） 免疫荧光检测SIRT3（绿色）在健康皮肤（n=8）和白癜风周围皮肤（n=8）中表达的代表性图像。表皮黑素细胞用抗黑素A抗体染色（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺=50μm（放大倍数：左侧=600×；右侧=1800×）。EP，表皮；DE，真皮。条形图表示每个样本8个样本和10个视野的平均值。显示平均值±SD。（B） 免疫荧光检测健康皮肤（n=8）和白癜风周围皮肤（n=8）中Ac-SOD2（绿色）表达的代表性图像。表皮黑素细胞用抗黑素A抗体染色（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺=50μm（放大倍数：左侧=600×；右侧=1800×）。使用Image J软件定量黑素细胞中SIRT3信号的强度。条形图表示每个样本8个样本和10个视野的平均值。显示平均值±SD。p值由双尾Student计算t吨-测试。**p<0.01。
图3
图3
SIRT3缺乏导致黑素细胞的细胞凋亡和线粒体功能障碍。（A） 用不同浓度的H处理转染si-NC或si-SIRT3的PIG1细胞2O（运行）2（0、0.5、1.0 mM），用CCK-8测定细胞活力。si-NC是指阴性对照小干扰RNA，si-SIRT3是指针对SIRT3的小干扰RNA。数据表示平均值±SD（n=3）。（B） 用si-NC或si-SIRT3转染的PIG1细胞在H后的凋亡水平2O（运行）2流式细胞仪检测治疗24h。条形图表示平均值±SD（n=3）。（C） 免疫印迹法检测PIG1细胞凋亡相关蛋白水平。数据是三个独立实验的代表。所示凋亡相关蛋白的定量分析（平均值±SD，n=3）。（D） 通过MitoSOX™Red线粒体超氧化物指示染色检查PIG1细胞的线粒体ROS水平。条形图表示平均值±SD（n=3）。（E） 如图所示，评估PIG1细胞中的ATP水平。数据表示三份样品的平均值±SD。（F） JC-1染色检测PIG1细胞线粒体膜电位水平。流式细胞仪分析的散点图显示了JC-1聚集体（红色）和JC-1单体（绿色）细胞群的分布。直方图计算了红色荧光与绿色荧光的相对比率（平均值±SD，n=3）。p值由双尾Student计算t吨-测试。*p＜0.05，**p<0.01，***p<0.001，NS，无显著性。
图4
图4
SIRT3依赖性线粒体动力学重塑在氧化应激下协调细胞色素c释放和呼吸复合物活性。（A，B）PIG1细胞在1.0 mM H处理后转染si-NC或si-SIRT32O（运行）2对于24小时，si-NC是指阴性对照小干扰RNA，si-SIRT3是指针对SIRT3的小干扰RNA。用1.0 mM H处理后，用质粒OE-NC或OE-SIRT3转染PIG3V细胞2O（运行）224 h。OE-NC指用对照质粒转染，OE-SIRT3指用SIRT3质粒转染。检测线粒体或细胞质中细胞色素c的表达。TOMM20被检测为线粒体部分的负荷控制。微管蛋白被检测为细胞溶质部分的负荷控制。检测β-肌动蛋白作为全细胞裂解液的负荷控制。数据是三个独立实验的代表。（C） 如图所示，在PIG1和PIG3V细胞中测量呼吸复合物I、II、III、IV和V的相对酶活性。数据表示三份样品的平均值±SD。（D） 如图所示，PIG1和PIG3V细胞经处理后线粒体网络的典型共焦显微镜图像。比例尺=50μm（放大倍数：上部=600×，下部=1800×）。定量PIG1和PIG3V细胞（每个样品100个细胞）与微管化、中间化和碎片化线粒体的比例。数据是三个独立实验的代表。（E） PIG1和PIG3V细胞线粒体网络的典型透射电镜图像。比例尺=500 nm。用Image J软件定量PIG1和PIG3V细胞的线粒体长度。每个治疗组随机选择100个线粒体。数据是三个独立实验的代表。显示平均值±SD。p值由双尾Student计算t吨-测试。*p＜0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图5
图5
SIRT3缺陷通过OPA1导致细胞凋亡和线粒体功能障碍。（A） 用H处理后，在转染si-NC或si-SIRT3的PIG1细胞中测定OPA1的乙酰化水平2O（运行）2联合免疫沉淀分析。数据是三个独立实验的代表。（B） 用si-SIRT3和OPA1质粒（OE-OPA1）或对照质粒（OE-NC）共同转染PIG1细胞，然后用1.0 mM H2O（运行）2对于24小时，si-NC是指阴性对照小干扰RNA，si-SIRT3是指针对SIRT3的小干扰RNA。显示了PIG1细胞线粒体网络的典型共焦显微镜图像。比例尺=50μm（放大倍数：上部=600×，下部=1800×）。定量PIG1和PIG3V细胞（每个样品100个细胞）与微管化、中间化和碎片化线粒体的比例。数据是三个独立实验的代表。（C） 细胞色素C在PIG1细胞线粒体或细胞质室中的表达。TOMM 20被检测为线粒体部分的负荷控制。微管蛋白被检测为细胞溶质部分的负荷控制。检测β-肌动蛋白作为全细胞裂解液的负荷控制。（D） 在经过指定处理的PIG1细胞中测量呼吸复合物I、II、III、IV和V的相对酶活性。数据表示三份样品的平均值±SD。（E） annexin V-FITC/PI染色检测PIG1细胞凋亡水平（平均值±SD，n=3）。（F） PIG1细胞中凋亡相关蛋白的水平。（G） 采用MitoSOX™Red线粒体超氧化物指示染色法检测经指示处理的PIG1细胞的线粒体ROS水平。条形图表示平均值±SD（n=3）。（H） JC-1染色分析PIG1细胞线粒体膜电位水平。流式细胞仪分析的散点图显示了JC-1聚集体（红色）和JC-1单体（绿色）细胞群的分布。直方图计算了红色荧光与绿色荧光的相对比率（平均值±SD，n=3）。（一） 如图所示，评估PIG1细胞中的ATP水平。数据表示三份样品的平均值±SD。p值由双尾Student计算t吨-测试。**p<0.01，***p<0.001。
图6
图6
氧化应激同时损害SIRT3活性和转录。（A） 通过使用免疫荧光检测8-OHdG（绿色）在健康皮肤（n＝8）和白癜风病变周围皮肤（n＝8）中的表达的代表性图像。黑素细胞用抗黑素A抗体染色（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺=50μm（放大倍数：左侧=600×；右侧=1800×）。使用Image J软件定量黑素细胞中8-OHdG信号的强度。条形图表示每个样本8个样本和10个视野的平均值。显示平均值±SD。（B） 用1.0 mM H处理PIG1和PIG3V细胞2O（运行）2持续24小时。通过检测SIRT3和DNPH之间的相互作用，对细胞提取物进行验证SIRT3的卡宾化。数据表示平均值±SD（n=3）。用1.0 mM H处理（C，D）PIG1和PIG3V细胞2O（运行）2检测PIG1和PIG3V细胞中PGC1αmRNA和蛋白水平。数据表示平均值±SD（n=3）。（E） 经指示处理后，PGC1α富集至SIRT3启动子。数据以平均值±标准差表示。（F）使用免疫荧光检测健康皮肤（n=8）和白癜风周围皮肤（n=8）中PGC1α（绿色）表达的代表性图像。用抗黑色素A抗体（红色）染色黑色素细胞。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺=50μm（放大倍数：左侧=600×；右侧=1800×）。使用Image J软件定量黑素细胞中PGC1α信号的强度。条形图表示每个样本8个样本和10个视野的平均值。显示平均值±SD。p值由双尾Student计算t吨-测试。*p＜0.05，**p<0.01，***p<0.001，NS，无显著性。
图7
图7
HKL通过激活SIRT3-OPA1轴保护白癜风黑素细胞免受氧化应激。（A-B）PIG3V细胞用5μM HKL预处理24 h，然后用1.0 mM h处理2O（运行）2用qRT-PCR和免疫印迹法检测SIRT3的mRNA和蛋白水平。（C） 使用SIRT3活性测定试剂盒，根据酶反应测定PIG3V细胞经上述处理后的SIRT3活力。数据表示平均值±SD（n=3）。（D） 检测处理后PIG3V细胞中SOD2和Ac-SOD2的蛋白水平。显示平均值±SD（n=3）。（E） 治疗后PIG3V细胞线粒体网络的典型共焦显微镜图像如图所示。比例尺=50μm（放大倍数：上部=600×，下部=1800×）。定量了PIG3V细胞（每个样品100个细胞）与微管化、中间化和碎片化线粒体的比例。（F） 用annexin V-FITC/PI染色法检测PIG3V细胞经上述处理后的凋亡水平。通过MitoSOX™红色线粒体超氧化物指示物染色检测经指示处理的PIG3V细胞的线粒体ROS水平。用JC-1染色法分析处理后PIG3V细胞线粒体膜电位水平。如图所示，评估PIG3V细胞中的ATP水平。数据表示三份样品的平均值±SD。（G） 治疗后PIG3V细胞线粒体网络的典型共焦显微镜图像如图所示。si-NC是指阴性对照小干扰RNA，si-OPA1是指针对OPA1的小干扰RNA。比例尺=50μm（放大倍数：上部=600×，下部=1800×）。定量了PIG3V细胞（每个样品100个细胞）与微管化、中间化和碎片化线粒体的比例。（H） 用annexin V-FITC/PI染色法检测PIG3V细胞经上述处理后的凋亡水平。通过MitoSOX™红色线粒体超氧化物指示物染色检测经指示处理的PIG3V细胞的线粒体ROS水平。用JC-1染色法分析处理后PIG3V细胞线粒体膜电位水平。如图所示，评估PIG3V细胞中的ATP水平。数据表示三份样品的平均值±SD。（一） 免疫印迹法检测治疗后PIG3V细胞凋亡相关蛋白的水平。（J） western blotting检测处理后PIG3V细胞线粒体或细胞质中细胞色素c的水平。TOMM20被检测为线粒体部分的负荷控制。微管蛋白被检测为细胞溶质部分的负荷控制。检测β-肌动蛋白作为全细胞裂解液的负荷控制。（K） 如图所示，在PIG3V细胞中测量呼吸复合物I、II、III、IV和V的相对酶活性。数据表示三份样品的平均值±SD。p值由双尾Student计算t吨-测试。*p＜0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图8
图8
SIRT3-OPA1通路调节氧化应激下黑素细胞的线粒体动力学和细胞凋亡。氧化应激增强正常人黑素细胞中SIRT3的表达和活性，但抑制白癜风黑素细胞的SIRT3表达和活性。vililigo黑素细胞中SIRT3缺陷通过诱导OPA1的超乙酰化，导致细胞色素c从线粒体释放到细胞质，以及呼吸复合物活性不足，从而导致白癜风中的线粒体分裂，最终激活凋亡途径并导致黑素细胞破坏。
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