microRNA-21-5p dysregulation in exosomes derived from heart failure patients impairs regenerative potential

doi:10.1172/JCI123135

.2019年4月29日；129(6):2237-2250.

doi:10.1172/JCI123135。

心力衰竭患者外泌体中microRNA-21-5p的失调损害再生潜能

附属公司

¹河北医科大学第二医院心内科，石家庄，中国。
²美国北卡罗来纳州罗利市北卡罗莱纳州立大学分子生物医学科学系。
^三美国北卡罗来纳州罗利市北卡罗莱纳大学教堂山分校和北卡罗莱那州立大学生物医学工程系。
⁴美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学病理学和实验医学系。
⁵郑州大学第一附属医院心内科，郑州，中国。

PMID： 31033484
预防性维修识别码：第546482页
内政部： 10.1172/JCI123135

心力衰竭患者外泌体中microRNA-21-5p的失调损害再生潜能

李乔等。临床研究杂志. 2019.

.2019年4月29日；129(6):2237-2250.

doi:10.1172/JCI123135。

作者

附属公司

¹河北医科大学第二医院心内科，石家庄，中国。
²美国北卡罗来纳州罗利市北卡罗莱纳州立大学分子生物医学科学系。
^三美国北卡罗来纳州罗利市北卡罗莱纳大学教堂山分校和北卡罗莱那州立大学生物医学工程系。
⁴美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学病理学和实验医学系。
⁵郑州大学第一附属医院心内科，郑州，中国。

PMID： 31033484
预防性维修识别码： PMC6546482型
内政部： 10.1172/JCI123135

摘要

外泌体作为治疗细胞的功能性旁分泌单位，可以部分复制其亲本细胞的修复特性。外泌体的构成及其生物活性在很大程度上取决于分泌它们的细胞。我们从心衰患者（FEXO）或正常供体心脏（NEXO）的外植体衍生心脏基质细胞中分离出外泌体，并比较其体内外再生活性。FEXO组患者在体外促进内皮管形成和心肌细胞增殖的能力受损。心肌内注射NEXO可改善急性心肌梗死小鼠模型的结构和功能。相反，FEXO治疗加剧了心脏功能和左心室重构。microRNA阵列和PCR分析显示FEXO中miR-21-5p的调节异常。恢复miR-21-5p的表达挽救了FEXO的修复功能，而减弱NEXO中miR-21-5p的表达则降低了其治疗益处。进一步的机制研究表明，miR-21-5p通过抑制磷酸酶和张力蛋白同源物增强Akt激酶活性。综上所述，心力衰竭的病理状况改变了心肌源性外泌体的miR货物，并损害了它们的再生活动。miR-21-5p通过磷酸酶和张力蛋白同系物/Akt途径促进血管生成和心肌细胞存活，从而促进外泌体介导的心脏修复。

关键词：心脏病学；心力衰竭；人干细胞；小鼠模型；干细胞。

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数字

**图1。外泌体处理对体外心肌细胞、内皮细胞和心脏成纤维细胞的影响。**
(A类)显示NRCM摄取DiI-标记的NEXO和FEXO的典型荧光显微照片。在心肌细胞（绿色）的细胞质内可以看到胞内胞外体（红色）。比例尺：10μm。(B类)外泌体摄取定量(n个= 10). 双侧t吨测试。(C类)NEXO、FEXO或PBS治疗引起的NRCM增殖。白色箭头表示Ki-67⁺/α-SA⁺细胞。比例尺：20μm。(D类)增殖心肌细胞的定量(n个= 6). (E类)响应NEXO、FEXO或PBS治疗的凋亡NRCM。白色箭头表示TUNEL⁺/α-SA⁺细胞。比例尺：20μm。(F类)凋亡心肌细胞的定量(n个= 6). (**G公司**)与NEXO、FEXO或PBS共同培养的HUVEC中试管形成的测量。比例尺：100μm。(**H（H）**)HUVEC管平均长度的定量(n个= 20). (我)新生大鼠成纤维细胞在NEXO、FEXO或PBS治疗下发生表型转化为肌成纤维细胞。比例尺：20μm。(J型)肌成纤维细胞定量(n个= 12). **P（P）*< 0.05, ****P（P）*< 0.001. NS，无显著性。(D类,F类,**H（H）**、和J型)带Bonferroni事后校正的单向方差分析。所有数值均为平均值±SD。FEXO，来自心力衰竭患者心脏细胞的外泌体。NEXO，来自正常心脏供体心脏细胞的外泌体。

**图2。NEXO和FEXO治疗对急性心肌梗死小鼠模型的影响。**
(A类和B类)在基线检查时（心肌梗死前1天）通过超声心动图测量LVEF(A类)和终点（心肌梗死后3周）(B类). (C类)各组的治疗效果（与基线相比，3周时LVEF的变化）(A类——C类,n个=每个治疗组9只动物，n个=假手术组的3只动物）。(D类)NEXO、FEXO或PBS治疗3周后心肌切片的代表性Masson三色染色。比例尺：0.5 mm(E类——**G公司**)Masson心脏切片中梗死面积、梗死壁厚度和存活组织的定量分析(n个=每个治疗组8只动物）**P（P）*< 0.05, ****P（P）*< 0.001. 带Bonferroni事后校正的单向方差分析。所有数值均为平均值±SD。FEXO，来自心力衰竭患者心脏细胞的外泌体。NEXO，来自正常心脏供体心脏细胞的外泌体。

**图3。外泌体介导的心脏修复机制。**
(A类)心肌梗死后心脏切片的代表性图像，Ki-67（绿色）、α-SA（红色）和DAPI染色。白色边界表示梗死区域，白色箭头表示Ki-67⁺近红外区的细胞。比例尺：10μm(B类)NEXO、FEXO或PBS治疗后，心脏切片用vWF（红色）、α-SA（绿色）染色。白色箭头表示近断层带中的毛细管结构。比例尺：50μm。(C类)心脏切片用TUNEL（绿色）、α-SA（红色）和DAPI（蓝色）染色。白色箭头表示梗死周围区域的心肌细胞凋亡。比例尺：50μm。(D类)循环心肌细胞（Ki-67）的定量⁺/α-SA⁺). (E类)毛细管密度定量（vWF⁺). (F类)心肌细胞凋亡定量（TUNEL⁺/α-SA⁺). (D类——F类)n个=每组6只动物，每只动物3个心脏切片**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, ****P（P）*< 0.001. 带Bonferroni事后校正的单向方差分析。所有数值均为平均值±SD。FEXO，来自心力衰竭患者心脏细胞的外泌体。NEXO，来自正常心脏供体心脏细胞的外泌体。

**图4。心力衰竭外泌体miR-21-5p调节异常。**
(A类)显示NEXO或FEXO中miRNA丰度翻倍变化的miRNA阵列(n个=3个生物复制，每个生物复制3个技术复制）。(B类)维恩图显示了NEXO和FEXO之间的可变miRNA分布。(C类)RT-PCR分析证实miR-21-5p在NEXO中高度富集(n个=3个生物复制，每个生物复制3个技术复制）****P（P）*< 0.001. NS，无显著性。双侧t吨测试。所有数值均为平均值±SD。FEXO，来自心力衰竭患者心脏细胞的外泌体。NEXO，来自正常心脏供体心脏细胞的外泌体。

**图5。在外显体中操纵miR-21-5p可调节其体外促血管生成和抗凋亡活性。**
(A类)在NEXO中miR-21-5p敲除后，抗凋亡作用减弱。白色箭头表示TUNEL⁺细胞。比例尺：50μm。(B类)凋亡细胞的定量(n个= 6). (C类)敲低miR-21-5p可降低NEXO的促血管生成作用。比例尺：50μm。(D类)平均管长度的定量(n个= 10). (E类)增强FEXO中miR-21-5p的表达部分挽救了其促进心肌细胞增殖的能力。比例尺：50μm。(F类)凋亡细胞的定量(n个= 6). (**G公司**)试管形成试验显示FEXO的促血管生成活性增强，miR-21-5p表达恢复。比例尺：50μm。(**H（H）**)平均管长度的定量(n个= 10). ****P（P）*< 0.001. 双侧t吨测试。所有数值均为平均值±SD。FEXO+miR-scr，即用打乱的miR寡核苷酸转染心力衰竭患者心肌细胞的外泌体。FEXO+miR-21，来源于用miR-21-5p寡核苷酸转染的心力衰竭患者的心脏细胞的外泌体。NEXO+miR-scr，来源于正常心脏细胞的外泌体，经打乱miR寡核苷酸转染。NEXO+抗miR-21，来自转染抗miR-21-5p寡核苷酸的正常心脏细胞的外泌体。FEXO，来自心力衰竭患者心脏细胞的外泌体。NEXO，来自正常心脏供体心脏细胞的外泌体。

**图6。在外泌体中操纵miR21可调节其治疗效力。**
用抗miR-21-5p寡核苷酸（NEXO+抗miR-21）转染健康心肌细胞，产生miR-21-5缺失的外泌体。通过用miR-21-5p寡核苷酸（FEXO+miR-21）转染心力衰竭心肌细胞，然后进行培养基调节和外显子分离，构建miR-21-5β-修复的外显子。使用加扰miR寡核苷酸作为对照（NEXO/FEXO+miR-scr）。(A类)治疗3周后用超声心动图测定LVEF。(B类)计算各组的治疗效果（与基线相比，3周时LVEF的变化）。(C类和D类)治疗3周后心肌切片的代表性Masson三色染色。比例尺：1 mm(E类——**G公司**)从Masson的三色染色图像定量分析梗死面积、梗死壁厚度和活组织。n个=每组6只动物**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, ****P（P）*< 0.001. 带Bonferroni事后校正的单向方差分析。所有值均为平均值±SD。

**图7。在外显体中操纵miR21可调节其体内促血管生成和抗凋亡活性。**
(A类)心肌梗死后心脏切片的代表性图像用vWF（绿色）、α-SA（红色）和DAPI（蓝色）染色。白色圆圈表示近区毛细血管。比例尺：100μm。(B类)毛细管密度定量（vWF⁺). (C类)心脏切片用TUNEL（绿色）、α-SA（红色）和DAPI（蓝色）染色。白色方块表示近梗死区心肌细胞凋亡。比例尺：50μm。(D类)心肌细胞凋亡定量（TUNEL⁺/α-SA⁺). (E类)心肌梗死后心脏切片的代表性图像用vWF（绿色）、α-SA（红色）和DAPI（蓝色）染色。白色圆圈表示近区毛细血管。比例尺：50μm。(F类)毛细管密度定量（vWF⁺). (**G公司**)心脏切片用TUNEL（绿色）、α-SA（红色）和DAPI（蓝色）染色。白色方块表示近梗死区心肌细胞凋亡。比例尺：50μm。(**H（H）**)心肌细胞凋亡定量（TUNEL⁺/α-SA⁺). (B类,D类,F类、和**H（H）**)n个=每组6只动物，每只动物3个心脏切片***P（P）*<0.01。双侧t吨测试。所有数值均为平均值±SD。FEXO+miR-scr，即用打乱的miR寡核苷酸转染心力衰竭患者心肌细胞的外泌体。FEXO+miR-21，来自转染miR-21-5p寡核苷酸的心力衰竭患者心脏细胞的外泌体。NEXO+miR-scr，来源于正常心脏细胞的外泌体，经打乱miR寡核苷酸转染。NEXO+抗miR-21，来自转染抗miR-21-5p寡核苷酸的正常心脏细胞的外泌体。

**图8。miR-21-5p靶向心肌梗死后病理学中的PTEN通路。**
(A类)典型的Western blot图像显示各种PTEN/Akt通路成分的表达。(B类——E类)PTEN、p-Akt、t-Akt，Bcl-2和caspase-3水平的定量(n个= 3). (F类)典型的Western blot图像显示PCNA（增殖标记）、VEGF和PDCD4（miR-21靶点）的表达。(**G公司**和**H（H）**)PCNA、VEGF和PDCD4水平的定量(n个= 3). (B类——我)所有miR-21组均归一化为相关的加扰对照组**P（P）*与加扰控制相比<0.05***P（P）*与加扰控制相比<0.01****P（P）*与加扰控制相比<0.001。与加扰控制相比，NS没有显著性。双侧t吨测试。所有值均为平均值±SD(J型)示意图显示了我们研究的工作模式。CM/H9C2/EC/CF+miR-scr，HCs/H9C2细胞/HUVECs/用打乱miR转染的人心脏成纤维细胞。CM/H9C2/EC/CF+miR-21，HCs/H9C2细胞/HUVECs/转染miR-21-5p模拟物的人心脏成纤维细胞。

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1. 唐杰等。纳米凝胶包裹的人心脏干细胞在心肌梗死小鼠和猪中的心脏修复。ACS纳米。2017;11(10):9738–9749. doi:10.1021/acsnano.7b01008。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
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[2] 罗磊，等。用于治疗小鼠急性心肌梗死的合成间充质干细胞的制备。2017年Circ Res；120(11):1768–1775. doi:10.11161/CIRCRESAHA.116.310374。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[5] 唐杰等。纳米凝胶包裹的人心脏干细胞在心肌梗死小鼠和猪中的心脏修复。ACS纳米。2017;11(10):9738–9749. doi:10.1021/acsnano.7b01008。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[6] 唐杰等。纳米凝胶包裹的人心脏干细胞在心肌梗死小鼠和猪中的心脏修复。ACS纳米。2017;11(10):9738–9749. doi:10.1021/acsnano.7b01008。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[9] Kreke M、Smith RR、Marbán L、Marbín E。心球和心球衍生细胞作为心肌梗死后的治疗药物。心血管治疗专家Rev。2012;10(9):1185–1194. doi:10.1586/erc.12.102。-内政部-公共医学

[10] Kreke M、Smith RR、Marbán L、Marbín E。心球和心球衍生细胞作为心肌梗死后的治疗药物。心血管治疗专家Rev。2012;10(9):1185–1194. doi:10.1586/erc.12.102。-内政部-公共医学

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