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.2019年4月25日；8（4）：生物039453。
doi:10.1242/bio.039453。

软基质通过延缓衰老维持人类间充质干细胞长期扩增的增殖和脂肪分化潜能

桑杰·库马尔·库雷尔 1, 潘卡伊·莫哈 1, 阿克沙达·卡德佩卡 1, 瓦德曼·库马尔 1, 罗希特·乔希 1, 悉达多·达斯 1, 杰耶什·贝拉雷 1, Abhijit Majumder公司 2
附属公司

软基质通过延缓衰老维持人类间充质干细胞长期扩增的增殖和脂肪分化潜能

桑杰·库马尔·库雷尔等。 Biol开放. .

摘要

人类间充质干细胞（hMSCs）在体外扩张，逐渐失去其独特的纺锤体形态、自我更新能力、多谱系分化潜能，进入复制衰老。细胞功能的丧失是需要大量细胞的临床应用的主要障碍。在这里，我们展示了基底刚度在hMSCs长期扩张的维持中的新作用。在杨氏模量聚丙烯酰胺凝胶上，从第3代到第18代连续传代45天E类=5 kPa时，hMSCs保持其增殖速度，与在塑料培养板上培养的hMSCs相比，其群体倍增了9倍。它们不表达衰老标记，保持其形态和其他机械特性，如细胞硬度和细胞牵引力，并且在脂肪分化潜能方面显著优于其他。这些结果在来自两种不同来源（脐带和骨髓）的hMSCs中得到了证实。总之，我们的结果表明，软凝胶是维持间充质干细胞干细胞干的合适基质。由于聚丙烯酰胺凝胶的制备是一项成熟且标准化的方案，我们认为这种新型的细胞扩增系统将有助于hMSCs的治疗和研究应用。

关键词：细胞力学；间充质干细胞；衰老；茎干；基底刚度。

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数字

图1。
图1。
hMSCs在TCP上长期传代后失去形态并进入复制性衰老。（A）EP（通道数≤6）（B）MP（通道数>6且≤10）和（C）LP（通道数>10）的代表性显微照片表明在体外扩张后，MSC失去纺锤状形态，变大变平。白色箭头显示形状不规则的大单元格。（D） 在传代过程中，平均细胞分布面积从～3000–4500显著增加 微米2. (N个=3,n个=至少150）。与EP细胞相比，MP和LP细胞中的（E–G）β-半乳糖染色（衰老标记）显著增加。白色箭头表示β-gal阳性细胞。（H） 衰老细胞和非衰老细胞的扩散面积：无论传代如何，衰老细胞比非衰老细胞具有更多的扩散面积(N个=3,n个>100). 结果表示为平均值±s.e.m*P（P）<0.05. 比例尺：100µm。
图2。
图2。
在连续传代过程中，软基质保持细胞形态、扩张和增殖速度。胶原涂层TCP上的（A）EP（传代数≤6）和（B）LP（传代次数>10）UC-hMSCs的代表性相位对比图，以及软凝胶上的（C）EP和（D）LP的代表性相对比图。（E） 小区扩展面积随TCP的通过而增加；然而，细胞在凝胶上的铺展面积在传代之间没有显著差异。(N个=3,n个=150）。（F） 如B中的白色箭头所示，在TCP培养的LP细胞中突起的数量显著增加(N个=3,n个=150). （G） 凝胶上的LP UChMSCs表现出明显低于TCP上的牵引力。实验使用了两个生物样品(N个=3,n个=20). （H） 在传代过程中，在凝胶和TCP上培养的UC-hMSCs的DT。虽然在TCP上培养时，DT随传代而增加，但在5上培养时仍不受影响 kPa凝胶。EP和MP的DT差异可以忽略不计，而LP的差异非常显著(N个=3,n个=1）。（一） 通过凝胶和TCP培养UC-hMSCs的CPD。凝胶上UChMSCs的CPD线性增加，但TCP上培养的细胞接近稳定(N个=1,n个=11). （J） 细胞核与DAPI（蓝色）和BrdU（红色）共同染色的免疫荧光图像捕获了循环细胞的相对百分比。（K） 凝胶中P14（LP）的BrdU阳性细胞百分率显著高于TCP中的细胞百分率，尽管凝胶和TCP中EP（P6）细胞没有显著差异。这些数据再次证实，如果在软凝胶上培养，细胞保持其增殖潜力。结果表示为平均值±标准误差*P（P）<0.05, **P（P）<0.001, ***P（P）<0.0001. 比例尺：100 微米。
图3。
图3。
软基质延缓衰老。（A–G）β-半乳糖（蓝色）染色的细胞是一个成熟的衰老标记，显示TCP在传代过程中衰老逐渐增加，但在凝胶上，在最初增加后，衰老保持不变（EP：传代数≤6，MP：传代次数>6和≤10，LP：传代数量>10）。同样用G表示(N个=3,n个=400). 结果表示为平均值±标准误差*P（P）<0.05. 比例尺：200 微米。（H–N）TCP和凝胶上生长的LP UC-MSC之间总核Lamin B1（红色）表达的比较。与凝胶（K-M）上的UC-hMSCs相比，TCP（H-J）上的Lamin B1表达减少。强度定量显示，在凝胶上的UC-hMSCs传代后期，层蛋白B1保持不变（N）(N个=2,n个=22）。此外，比较塑料（TCP）（O–Q）和凝胶（R–T）上晚期传代UC-hMSCs的Lamin A表达，发现Lamin A在TCP上表达更多。图（U）中对其进行了量化(N个=2,n个=20). 结果表示为平均值±标准差**P（P）<0.001. 比例尺：（H–T）10 微米。
图4。
图4。
凝胶上的长期培养不会改变表面标记的表达，但有助于干细胞保持分化潜能。流式细胞术分析凝胶（A–D）和TCP（E–H）中UC-hMSCs在LP（P22）处的表面多能性标记的表达。表面标记物CD105、CD44、CD90和Stro-1的表达没有因凝胶上UChMSCs的长期培养而改变。A、B、E和F中的红色曲线是细胞的自荧光，蓝色填充的直方图是染色标记的荧光信号。（I–N）成脂分化：将凝胶和TCP中的LP hMSCs（P14）培养在成脂诱导培养基中。（I–K）在7周后检查早期脂肪生成标记物PPAR-γ的表达 使用凝胶（I）和TCP（J）中UC-hMSCs的免疫染色进行脂肪诱导天数（蓝色细胞核中的紫红色斑点，如白色箭头所示）。与TCP培养的细胞相比，凝胶上连续传代的UC-hMSCs表现出较高的PPAR-γ表达，用K定量(N个=2,n个=273, ***P（P）<0.001). （L–N）14之后 在脂肪诱导的第天，凝胶（L）细胞中的脂滴积累显著高于TCP（M）细胞。通过油红O染色鉴定脂滴。与TCP相比，凝胶基质上的油红O阳性细胞百分比更高，如N(N个=2,n个=100). 白色箭头显示有和没有油滴积聚的细胞。比例尺：50 微米。
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