Modulation of proliferation and differentiation of gingiva‑derived mesenchymal stem cells by concentrated growth factors: Potential implications in tissue engineering for dental regeneration and repair

doi:10.3892/ijmm.2019.4172

.2019年7月；44(1):37-46.

doi:10.3892/ijmm.2019.4172。 Epub 2019年4月24日。

浓缩生长因子对牙龈间充质干细胞增殖和分化的调节：组织工程在牙再生和修复中的潜在意义

小陈¹, 陈玉禾², 侯雅丽^三, 彭松^三, 周敏岳², 闵海聂², 刘旭谦²

附属公司

¹中国四川省绵阳市绵阳口腔医院正畸科，邮编621000。
²西南医科大学口腔颌面重建与再生实验室，四川省泸州市，646000。
^三河北医科大学口腔医学院口腔病理科，河北省石家庄市，邮编050000。

PMID： 31017269
预防性维修识别码：项目经理6559294
内政部： 10.3892/ijmm.2019.4172

浓缩生长因子对牙龈间充质干细胞增殖和分化的调节：组织工程在牙再生和修复中的潜在意义

小陈等。国际分子医学杂志. 2019年7月.

.2019年7月；44(1):37-46.

doi:10.3892/ijmm.2019.4172。 Epub 2019年4月24日。

作者

小陈¹, 陈玉禾², 侯雅丽^三, 彭松^三, 周敏岳², 闵海聂², 刘旭谦²

附属公司

¹中国四川省绵阳市绵阳口腔医院正畸科，邮编621000。
²西南医科大学口腔颌面重建与再生实验室，四川省泸州市，646000。
^三河北医科大学口腔医学院口腔医院口腔病理科，河北省石家庄市，邮编050000。

PMID： 31017269
预防性维修识别码：项目经理6559294
内政部： 10.3892/ijmm.2019.4172

摘要

本研究的目的是评估用不同浓度的浓缩生长因子（CGF）培养的牙龈间充质干细胞（GMSC）的增殖和成骨分化能力。从牙龈结缔组织中分离出GMSCs，并通过流式细胞术、免疫荧光染色和免疫组织化学染色进行鉴定。用MTT法测定细胞增殖活性，用细胞计数试剂盒（CCK）‑8法检测CGF对MCSCs的影响。通过碱性磷酸酶（ALP）阳性细胞染色和矿化结节形成试验评估矿化诱导。通过逆转录定量聚合酶链反应（RT‑qPCR）分析和western blotting评估牙本质基质酸性磷酸蛋白（DMP）1、牙本质唾液磷蛋白（DSPP）、骨形态发生蛋白（BMP）2和runt‑related transcription factor（RUNX）2 mRNA和蛋白表达。流式细胞术、免疫荧光染色和免疫组织化学染色结果表明，培养的细胞为GMSCs。MTT分析结果显示，第三代牙龈干细胞表现出最高的增殖能力，CCK‑8结果表明，10%CGF对GMSC增殖的促进作用最为显著。ALP活性分析和矿化结节分析表明，CGF可成功诱导GMSCs向成骨分化，而RT‑qPCR和western blot分析表明CGF通过调节DMP1、DSPP、BMP2和RUNX2的表达参与GMSCs的分化（P<0.05）。总之，CGF可以促进GMSCs的增殖和成骨分化。因此，CGF可以应用于组织工程牙再生修复。

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数字

图1
牙龈间充质干细胞的培养*在体外*（放大倍数，×100）。（A）原代培养：细胞呈长梭形或多边形。（B）继代培养：细胞表现出一致的形态，包括纺锤形，细胞体丰满，细胞核清晰，有成纤维细胞样表型。

图2
GMSC的特性。（A）流式细胞术分析表明，人GMSC表达CD73、CD105和CD90，但不表达CD45。（B）干细胞标记物在GMSCs中的表达。将培养在24孔板中的细胞固定，并用抗人波形蛋白、CD90、CD73和细胞角蛋白（CK）的特异性抗体染色。将细胞与罗丹明或异硫氰酸荧光素结合的二级抗体孵育，然后在荧光显微镜下观察（放大倍数×200）。（C）免疫荧光染色显示CD90和波形蛋白染色的细胞胞浆呈红色荧光，S100A4染色的细胞细胞质呈绿色荧光。所有细胞的细胞核都显示出蓝色荧光，而细胞角蛋白染色的细胞则没有荧光（放大倍率，×200）。GMSCs，牙龈衍生间充质干细胞。

图3
GMSCs增殖活性分析。MTT分析结果表明，GMSCs在接种后第3-4天呈对数增长，细胞数量在第7-8天趋于稳定。第三代细胞具有较强的增殖能力。龈间充质干细胞；外径，光密度。

图4
CGF。（A）通过离心获得以下血液分数：i）以血清为代表的优势期（血小板-贫血浆；PPP）；ii）中间阶段，表现为含有CGF、白细胞和干细胞的大而致密的聚合纤维蛋白凝块；和iii）下部红细胞（RBC）层。（B） CGF凝胶呈现出淡黄色凝胶状、半透明、柔软、有弹性、光滑的表面。（C）细胞计数试剂盒-8分析结果表明，光密度（OD）值随时间逐渐增加。与对照组相比，10%CGF显著促进GMSCs增殖。^*P<0.05。CGF，浓缩生长因子；GMSC，牙龈来源的间充质干细胞。

图5
CGF对不同时间点GMSC成骨分化的影响。（A） CGF对不同时间点GMSCs碱性磷酸酶活性的影响。数据表示为平均值±标准偏差。^*P<0.05表明纯矿化组与对照组相比；^**实验组与对照组P<0.01；^#试验组14天时与试验组7天时相比，P<0.05；^##实验组21天时与实验组7天时相比，P<0.01。（B）矿化结核形成分析。茜素红S染色结果表明，实验组矿化结节出现较早，数量和密度较高。矿化诱导后第21天成骨最显著（放大倍数，×200）。CGF，浓缩生长因子；GMSCs，牙龈衍生间充质干细胞。

图6
矿化诱导后第21天DSPP、DMP1、BMP2和RUNX2的mRNA表达。RT-qPCR结果表明，（A）DSPP、（B）DMP1、（C）BMP2和（D）RUNX2 mRNA表达显著增加。^*P<0.05表明纯矿化组与对照组相比；^**实验组与对照组相比P<0.01。牙本质唾液磷蛋白；DMP1，牙本质基质酸性磷酸蛋白1；骨形态发生蛋白2；RUNX2，runt-related转录因子2；RT-qPCR，逆转录定量聚合酶链反应。

图7
矿化诱导后第21天DSPP、DMP1、RUNX2和BMP2的蛋白表达。western blotting结果表明，DSPP、DMP1、BMP2和RUNX2蛋白表达显著增加。^*P<0.05表明纯矿化组与对照组相比；^**实验组与对照组相比P<0.01。牙本质唾液磷蛋白；DMP1，牙本质基质酸性磷酸蛋白1；骨形态发生蛋白2；RUNX2，runt-related转录因子2。

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