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.2020年2月;16(2):271-288.
doi:10.1080/15548627.2019.1606647。 Epub 2019年4月21日。

MTORC1协调骨关节炎颞下颌关节软骨细胞的自噬和凋亡信号

附属公司

MTORC1协调骨关节炎颞下颌关节软骨细胞的自噬和凋亡信号

杨洪旭等。 自噬. 2020年2月.

摘要

骨关节炎(OA)进展过程中软骨细胞从自噬到凋亡的转变,其机制目前尚不清楚。在这项研究中,我们在培养的软骨细胞中使用了流动流体剪切应力(FFSS)模型和单侧前交叉(UAC)动物模型。我们发现,FFSS和UAC都能在颞下颌关节(TMJ)软骨细胞中主动诱导内质网应激(ERS),HSPA5、p-EIF2AK3、p-ERN1和ATF6的表达显著增加就是明证。有趣的是,FFSS和UAC不仅激活了促死亡p-EIF2AK3介导的ERS-凋亡程序,还激活了软骨细胞中促生存p-ERN1介导的自噬通量。来自FFSS的数据表明,p-ERN1下游的MTORC1抑制自噬,但促进p-EIF2AK3介导的ERS-凋亡。UAC模型的数据表明,早期TMJ软骨细胞中p-ERN1和p-EIF2AK3均被激活,MTORC1被抑制。晚期,MTORC1-p-EIF2AK3介导的ERS凋亡占主导地位,而p-ERN1和自噬流量受到抑制。通过大鼠TMJ局部注射雷帕霉素抑制MTORC1或诱导消融小鼠软骨细胞选择性表达MTORC1,促进软骨细胞自噬并抑制凋亡,减少UAC诱导的TMJ软骨损伤。相反,TMJ局部给药MHY1485激活MTORC1或基因缺失Tsc1型上游MTORC1抑制物导致相反的效应。总之,我们的结果证实,异常的机械负荷通过激活MTORC1信号(至少部分地)导致软骨退行性变,该信号调节TMJ软骨细胞的自噬和凋亡程序。因此,抑制MTORC1为OA的预防和治疗提供了一种新的治疗策略。缩写:ACTB:肌动蛋白β;ATF6:激活转录因子6;BECN1:贝克林1;BFL:巴非霉素A1; CASP12:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12;CASP3:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3;DAPI:4',6-二氨基-2-苯基吲哚;DDIT3:DNA损伤诱导转录物3;EIF2AK3/PERK:真核翻译起始因子2α激酶3;ER:内质网;ERS:内质网应激;ERN1/IRE1:内质网至细胞核信号1;FFSS:流体剪切应力;HSPA5/GRP78/BiP:热休克蛋白5;LAMP2:溶酶体相关膜蛋白2;MAP1LC3B/LC3B:微管相关蛋白1轻链3β;MTOR:雷帕霉素激酶的机制靶点;MTORC1:雷帕霉素复合物1的机制靶点;OA:骨关节炎;PRKAA1/2/AMPK1/2:蛋白激酶,AMP活化,α1/2催化亚单位;RPS6:核糖体蛋白S6;Rapa:雷帕霉素;SQSTM1/p62:隔离体1;TEM:透射电子显微镜;TG:thapsigargin;TMJ:颞下颌关节;TSC1/2:结节性硬化综合征1/2;UAC:单侧前牙反牙合;UPR:未折叠蛋白反应;XBP1:x-box结合蛋白1。

关键词:自噬;软骨细胞;内质网应激;内质网-细胞核信号传导1;真核翻译起始因子2α激酶3;雷帕霉素复合物1的机制靶点;骨关节炎。

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数字

图1。
图1。
UAC对大鼠TMJ软骨细胞ERS-凋亡信号和自噬流量的影响。(a) 髁突软骨的藏红O染色。假手术组和UAC组大鼠颞下颌关节矢状中央区2~20周。比例尺:200μm。软骨面积的定量数据(右侧面板)。(b和c)在第4周和第8周使用抗CASP12和DDIT3抗体进行免疫组织化学(IHC)染色。各组CASP12-和DDIT3-阳性细胞的定量数据如图所示(右侧面板)。比例尺:200μm。(d) 实时RT-PCR(qPCR)分析案例12数据3假手术组和UAC组大鼠TMJ。(e) TUNEL染色。各组TUNEL阳性细胞百分比的定量数据(右侧面板)。白点,表面髁突软骨;蓝点,软骨和软骨下骨之间的边界。比例尺:100μm。(f) 免疫印迹法检测CASP12、DDIT3、BECN1、LC3B-I/II和SQSTM1的蛋白表达。(g) (f)的定量数据。(h和i)BECN1和LC3B-II的IHC染色。阳性细胞的定量数据(右侧面板)。(j) 免疫荧光(IF)染色检测自噬体和溶酶体的位置。LC3B-II punta,绿色;LAMP2点状,红色;DAPI,蓝色。比例尺,10μm。结果表示为平均值±标准偏差。藏红O和IHC染色:N个=6.Western blotting和qPCR分析:N个= 3. *P(P)< 0.05, **P(P)<0.01和***P(P)<0.001表示所示组之间存在显著差异。
图2。
图2。
UAC对大鼠TMJ软骨细胞MTORC1和ERS信号的影响。(a和b)在第4周和第8周使用HSPA5和p-EIF2AK3抗体进行IHC染色。显示了各组HSPA5-和p-EIF2AK3-阳性细胞的定量数据(右侧面板)。比例尺,200μm。(c) 基因表达的qPCR分析Hspa5、Eif2ak3、Atf6Ern1型假手术组和UAC组大鼠TMJ。(d) HSPA5、p-EIF2AK3、EIF2AK2、p-ERN1、ERN1、p-MTOR、MTOR、p-RPS6和RPS6的蛋白质印迹。(e) (d)的定量数据。(f和g)在第4周和第8周对p-ERN1和p-RPS6进行IHC染色。每组阳性细胞的定量数据如图所示(右侧面板)。比例尺:200μm。结果表示为平均值±标准偏差。IHC染色:N个=6.Western blotting和qPCR分析:N个= 3. *P(P)< 0.05, **P(P)<0.01和***P(P)<0.001表示所示组之间存在显著差异。
图3。
图3。
FFSS通过钙激活培养的ATDC5细胞ERS凋亡2+超载。(a) ATDC5细胞暴露于24达因/厘米2FFSS用于指定时间,并用钙荧光染料染色,然后用流式细胞术测量钙2+ER中的含量。(b)ATDC5细胞暴露于24达因/厘米2FFSS持续1 h,用10μM thapsigargin(TG)或无钙培养基(Ca)处理2+免费)。显示了每组的代表性图像。钙,绿色;ER,红色。比例尺:10μm。(c) 蛋白质印迹法检测HSPA5、p-EIF2AK3、EIF2AK2、p-ERN1和ERN1的蛋白表达。(d) ●●●●。(c)的定量数据。(e) mRNA表达的qPCR分析Hspa5、Eif2ak3、Ern1附件6(f)ATDC5细胞接受24达因/厘米2FFSS持续1、2和4小时。显示了6000X(左面板)和16500X(右面板)ATDC5电池的TEM图像。黑色箭头,未完全消化的细胞器和溶酶体酶颗粒;白色箭头,ER的展开。白色条:2μm。黑条:1μm。(g) 如(f)中那样处理ATDC5细胞,并对其进行TUNEL染色。TUNEL阳性细胞的定量数据(右图)。比例尺:50μm。(h-j)如(f)中那样处理ATDC5细胞,随后进行蛋白质印迹或qPCR分析以表达所指示的基因。定量数据显示在相应的右侧面板中。结果表示为平均值±标准偏差。N个= 3. *P(P)< 0.05, **P(P)<0.01和***P(P)<0.001表示所示组之间存在显著差异。
图4。
图4。
FFSS激活培养的ATDC5细胞中的自噬通量,但灭活MTORC1通路。(a) ATDC5细胞暴露于24达因/厘米2FFSS用于指示时间,western blot用于测量指示蛋白表达。(b) (a)的定量数据。(c) 免疫印迹法检测SQSTM1/p62和LAMP2蛋白表达,检测自噬流量。(d) ●●●●。ATDC5细胞按(a)处理。IF染色用于定位自噬体和溶酶体工作站。显示了每组的代表性图像。LC3B-II,绿色;LAMP2,红色;DAPI,蓝色。比例尺:10μm。(e) 巴非霉素A处理2小时和4小时FFSS刺激的ATDC5细胞IF染色1(BFL)。LC3B-II,绿色;LAMP2,红色;DAPI,蓝色。比例尺:10μm。(f) 24 dyne/cm处理的ATDC5细胞蛋白质表达的Western blotting2含或不含巴非霉素A的FFSS 2和4小时1治疗。定量数据显示在相应的右侧面板中。结果表示为平均值±标准偏差。N个= 3. *P(P)< 0.05, **P(P)<0.01和***P(P)<0.001表示所示组之间存在显著差异。
图5。
图5。
抑制p-EIF2AK3对FFSS诱导的软骨细胞ERS凋亡和自噬的影响。(a和b)ATDC5细胞受到24达因/厘米2使用或不使用1μM GSK2606414进行FFSS 2或4小时,然后进行western blotting以检测指示基因的表达。(c) 首先用GSK2606414处理ATDC5细胞,然后像(a,b)中那样进行FFSS,然后进行TUNEL染色。(d) 首先用GSK2606414处理ATDC5细胞,然后如(a,b)中那样进行FFSS,然后进行IF染色以定位自噬体和溶酶体站。LC3B-II,绿色;LAMP2,红色;DAPI,蓝色。比例尺:10μm。(e) 用2小时和4小时FFSS刺激ATDC5细胞,用GSK2606414处理,加或不加巴非霉素A,IF染色1(BFL)。LC3B-II,绿色;LAMP2,红色;DAPI,蓝色。比例尺:10μm。(f) Western blotting检测LC3B-I/II和SQSTM1/p62在ATDC5细胞中的蛋白表达,如(e)所示。(g) (f)的定量数据。N个= 3. *P(P)< 0.05, **P(P)<0.01和***P(P)<0.001表示所示组之间存在显著差异。
图6。
图6。
在存在FFSS的软骨细胞中,MTORC1促进p-EIF2AK3介导的ERS凋亡,但抑制自噬。(a-d)使用或不使用100 nM雷帕霉素处理ATDC5细胞,然后使用24达因/厘米2FFSS持续2或4小时,然后进行western blotting(a和b)或TUNEL染色(c)或qPCR分析(d)以检测指示基因的表达。比例尺:50μm。(e和f)用1μM MHY1485或1μM GSK2606414处理或两者同时处理的ATDC5细胞中p-RPS6、RPS6,p-MTOR、MTOR、p-EIF2AK3、EIF2AK2、CASP12和DDIT3表达的Western blot分析。N个= 3. *P(P)< 0.05, **P(P)<0.01和***P(P)<0.001表示所示组之间存在显著差异。
图7。
图7。
p-ERN1抑制MTORC1以减轻FFSS处理的软骨细胞中ERS-凋亡。(a-f型)ATDC5细胞用4μ8C(1μM)、雷帕霉素(100 nM)、4μ8C+雷帕霉素、ERN1慢病毒(ACT)感染或ACT+MHY1485(100nM)处理。两小时后,细胞接受FFSS(达因/厘米2)持续4 h,然后进行western blotting(a、b、d和e)和qPCR分析(c)以检测指示基因的表达,或TUNEL染色以检测细胞凋亡(f)。比例尺,50μm。(g) 4周和8周时使用抗p-PRKAA1/2抗体进行IHC染色。每组阳性细胞的定量数据如图所示(右侧面板)。比例尺:100μm。(h和i)用1μM 4μ8C或1μM A769662处理或两者同时处理的ATDC5细胞中指示标记的蛋白质印迹分析。结果表示为平均值±标准偏差。N个= 3. *P(P)< 0.05, **P(P)<0.01和***P(P)<0.001表示所示组之间存在显著差异。
图8。
图8。
MTORC1失活促进软骨细胞自噬,抑制软骨细胞凋亡,并防止UAC下软骨丢失。(a和b)每隔8至12周在UAC大鼠的TMJ区域注射100nM MTORC1抑制剂雷帕霉素(50μl,Rapa组)或等体积PBS(载体组)。在注射4周和12周后采集样品。制备髁突软骨用于蛋白质提取物的免疫印迹及其定量。(c) 12周时,对髁突软骨的矢状中央区进行番红O染色,以检测蛋白多糖和各组的阳性区域。IHC染色检测p-EIF2AK3、CASP12和DDIT3的表达。黑色刻度条:100μm。IF染色检测自噬体和溶酶体的位置。LC3B-II,绿色;LAMP2,红色;DAPI,蓝色。白色比例尺:10μm。(d-g)显示了各组软骨面积和p-EIF2AK3-、CASP12-和DDIT3-阳性细胞的定量数据。(h) 软骨细胞中MTORC1的软骨特异性缺失。按照材料和方法中的描述,对小鼠进行7周的UAC或假手术,并注射TM。IF染色:用抗p-RPS6抗体(S235/236)对颞下颌关节矢状面中央部分进行染色。p-RPS6,红色;DAPI,蓝色。髁突软骨表面的白点;绿点,软骨和软骨下骨之间的边界。藏红O(San O)染色。p-EIF2AK3的IHC染色。TUNEL染色。髁突软骨表面的白点;蓝点,软骨和软骨下骨之间的边界。比例尺:100μm。(i-l)(h)的量化。结果表示为平均值±标准偏差。藏红O、TUNEL和IHC染色:N个=6只大鼠,N个=5只小鼠。Western blotting和qPCR分析:N个= 3. *P(P)< 0.05, **P(P)<0.01和***P(P)<0.001表示所示组之间存在显著差异。
图9。
图9。
MHY1485激活MTORC1或基因缺失Tsc1型在UAC动物中抑制软骨细胞自噬并促进软骨细胞凋亡和TMJ软骨损失。(a) 从0周到4周,将50μl、100 nM MHY1485或等体积PBS注射到进行UAC手术的小鼠的TMJ区域。从髁突软骨中制备蛋白提取物,用于免疫印迹,以检测p-MTOR、p-RPS6、p-EIF2AK3、CASP12、DDIT3、BECN1和LC3B-I/II的表达。(b) (a)的定量数据。(c) 各组髁突软骨的矢状中央区切片进行藏红O染色。p-EIF2AK3、CASP12和DDIT3的IHC染色。黑色标尺,100μm。IF染色检测自噬体和溶酶体的位置。LC3B-II,绿色;LAMP2,红色;DAPI,蓝色。白色比例尺:10μm。(d-g)(C)的定量数据。(h) 删除Tsc1型软骨细胞中。小鼠接受UAC或假手术3周,并按照材料和方法中的描述注射TM。IF染色:用抗p-RPS6抗体(S235/236)对颞下颌关节矢状面中央部分进行染色。p-RPS6,红色;DAPI,蓝色。髁突软骨表面的白点;绿点,软骨和软骨下骨之间的边界。藏红O染色。p-EIF2AK3的IHC染色。TUNEL染色。髁突软骨表面的白点;蓝点,软骨和软骨下骨之间的边界。比例尺:100μm。(i-l)(H)的定量数据。结果表示为平均值±标准偏差。IHC染色:N个=大鼠为6,N个=小鼠为5。Western blotting和qPCR分析:N个= 3. *P(P)< 0.05, **P(P)<0.01和***P(P)<0.001表示所示组之间存在显著差异。。
图10。
图10。
一个工作模型表明,MTORC1在ERS细胞凋亡和自噬流量之间的串扰中的作用。UAC-FFSS诱导钙超载,并通过上调p-EIF2AK3和p-ERN1来促进ERS。ERN1-MTORC1信号启动自噬流量,MTORC1-EIF2AK3诱导软骨细胞中的ERS凋亡。MTORC1位于p-ERN1-p-PRKAA1/2(AMPK)下游,通过上调p-EIF2AK3,将软骨细胞的自噬转换为ERS-细胞凋亡,以应对长期的异常生物力学负荷,从而促进CASP12和DDIT3的表达,从而导致细胞凋亡,并通过抑制自噬体-溶酶体融合抑制细胞自噬。

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引用人

工具书类

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赠款和资金

本研究得到了国家自然科学基金(81530033、81500875、81500896、81371166、81630066、81700995、81472049和81870532)和广东省科技创新委员会(2017B030301018)的资助。