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.2019年4月18日;9(1):6243.
doi:10.1038/s41598-019-42737-2。

对戊型肝炎病毒生命周期关键因子ORF2衣壳蛋白的新见解

附属公司

对戊型肝炎病毒生命周期关键因子ORF2衣壳蛋白的新见解

马利基·安卡维等。 科学代表. .

摘要

戊型肝炎病毒(HEV)基因组编码三种蛋白质,包括ORF2衣壳蛋白。最近,我们证明了HEV产生三种不同形式的ORF2:(i)ORF2i型(感染性ORF2),它是感染性颗粒的组成部分;(ii)分泌性ORF2g(糖基化ORF2型)和ORF2c(裂解ORF2c型),它们与感染性颗粒无关,但是HEV感染患者血清中的主要抗原。ORF2蛋白序列包含三个高度保守的潜在N-糖基化位点(N1、N2和N3)。ORF2 N-糖基化在HEV生命周期中的地位和生物学相关性尚待阐明。在这里,我们生成了一系列ORF2突变体,其中三个N-糖基化位点分别或组合发生突变。我们证明ORF2g/c蛋白在N1和N3位点上是N-糖基化的,但在N2位点上不是。我们发现ORF2蛋白的N-糖基化在感染性HEV颗粒的复制和组装中不起任何作用。我们发现糖基化ORF2g/c形式是非常稳定的蛋白质,被患者抗体靶向。我们还证明ORF2i蛋白转位到感染细胞的细胞核中。因此,我们的研究为ORF2表达的分子机制提供了新的见解。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
野生型和突变ORF2蛋白序列的示意图。HEV ORF2蛋白是一种660个氨基酸的蛋白质。对应于信号肽的前23个氨基酸(aa)以粗体显示。指出了ORF2i、ORF2g和ORF2c蛋白的第一个aa的位置。三个潜在的N-糖基化位点以粗体显示(N1、N2和N3)。对于每个突变,显示了引入的突变。抑制N-糖基化的突变显示为红色,而不抑制N-糖基化的突变则显示为绿色。星星(******)代表1E6抗ORF2抗体的表位。
图2
图2
wt和突变ORF2蛋白的亚细胞分布。用wt和mt HEV RNA电穿孔PLC3细胞,并在盖玻片上生长。电穿孔后3天,细胞固定,ORF2蛋白用1E6抗体染色(红色)。细胞核用DAPI染色(蓝色)。通过共聚焦显微镜(放大倍数x40)分析细胞。介绍了两个独立实验的代表性采集。()表达野生型(wt)和N1S1(N137A)的细胞;N1S2(S139A);N1S3(S139T)突变体。(b)表达N2S1(N310A)的细胞;N2S2(T312A);N2S3(T312S)和N2S4(P313A)突变体。(c(c))表达N3S1(N562A)的细胞;N3S2(T564A);N3S3(T564S)突变体。(d日)表达Gly(−)(N1S2+N3S1)和Gly(+)(N133)的细胞 + N3S3)双突变体和未转染的PLC3细胞(CTL)。
图3
图3
western blot(WB)对wt和突变ORF2蛋白的表征。在10时收集wt和mt PLC3/HEV细胞的上清液和裂解液电穿孔后第天,通过蛋白质定量分析进行归一化,并使用1E6抗体通过WB检测ORF2蛋白。给出了两个独立实验的代表性结果。还原条件下细胞裂解液中ORF2内蛋白的检测()在非还原条件下(c(c)). 此外,还检测了Tubulin(Tub)以控制蛋白质负荷。还原条件下上清液中ORF2蛋白的检测(b)在非还原条件下(d日). 在(b),箭头表示ORF2i蛋白。重量和重量PLC3/HEV细胞裂解物(e(电子))和上清液((f))用肽-N-糖苷酶F(PNGaseF)消化(+)或不消化(-)。()将wt和mt PLC3/HEV细胞的上清液在37℃孵育指定时间摄氏度。相对ORF2蛋白量通过短时间暴露的密度测定法测量。将时间0天的值调整为100%。结果来自三个独立的实验。在(b), (d日)和((f)),虚线用于评估偏移剖面的偏移。为了清晰和简洁起见,删掉了污点。补充图3显示了全长印迹。
图4
图4
ORF2蛋白N-糖基化位点突变对抗体识别的影响。(b)在电穿孔后10天收集wt和mt PLC3/HEV细胞的上清液和裂解液。细胞裂解液和上清液中的蛋白质通过细胞裂解液的蛋白质定量分析进行归一化。如图所示,ORF2蛋白通过使用1E6线性抗ORF2抗体或4B2和2E2构象抗ORF2抗体进行免疫沉淀(IP)。显示了用于免疫沉淀的ORF2蛋白的输入。WB使用1E6抗体检测ORF2蛋白。(c(c))用Wantai HEV-Ag酶联免疫吸附试验检测上清液中的戊型肝炎病毒抗原Plus(加)套件。结果以信号截止比(S/CO)表示。(d日)一名非感染患者(N6)的血清和一名清除了HEV感染的患者(S30)的血清均用蛋白A-琼脂糖珠培养,然后用ORF2g/ORF2c蛋白(ORF2)或PBS(CTL)培养。接下来,WB使用1E6抗体检测ORF2蛋白。ORF2g/ORF2c蛋白在碘克沙醇垫上分离(e(电子))从wt和mt PLC3/HEV细胞上清液中分离的碘克沙醇垫上的(Top)ORF2g/c蛋白用S30固定珠免疫沉淀。使用来自用N6固定化珠免疫沉淀的wt PLC3/HEV细胞的上清液的ORF2g/c蛋白作为对照。(底部)显示了用于免疫沉淀的ORF2g/ORF2c蛋白的输入。给出了两个独立实验的代表性结果。为了清晰和简洁起见,删掉了污点。补充图4显示了全长印迹。
图5
图5
N-糖基化位点突变对ORF2蛋白核定位的影响。细胞质的()和核能(b)用NE-PER核和细胞质提取试剂盒制备wt和mt PLC3/HEV细胞的提取物。WB检测ORF2intra和ORF2ni核蛋白。还检测了层粘连蛋白B1和微管蛋白(Tub),以评估提取物的质量。给出了两个独立实验的代表性结果。(c(c))通过较短时间曝光的印迹密度测定法定量细胞质和核分馏中ORF2条带的强度。接下来计算ORF2ni/ORF2内比值。需要注意的是,由于凝胶上装载的核提取物是细胞溶质提取物的四倍,ORF2ni/ORF2的内部比率被除以四。(d日)将wt和mt PLC3/HEV细胞固定在第3天,并使用1E6抗体对ORF2蛋白进行染色。单元格(n = 50)使用x40油浸透镜通过LSM 800共焦激光扫描(Zeiss)进行分析。使用ImageJ软件测定ORF2蛋白的核荧光强度。为了清晰和简洁起见,删掉了污点。补充图5显示了全长印迹。
图6
图6
ORF2蛋白N-糖基化位点突变对病毒组装和传染性的影响。()用RT-qPCR(IU/ml)测定在第2、6和10天采集的wt和mt PLC3/HEV细胞上清液中的HEV RNA水平。对于每种情况,数值均表示为与在2 d.p.e下测得的RNA水平相比的倍数增加。提供的数据是两个重复进行的独立实验的平均值(b)用在第2、6和10天采集的上清液系列稀释液感染Naive Huh.7.5细胞。感染后3天,固定细胞,并用免疫荧光检测ORF2蛋白。确定了焦距形成单位(FFU),结果以FFU/mL表示。给出的数据是两个独立实验的平均值,共进行了三次。(c(c))在10 d.p.e.提取细胞内病毒颗粒,并通过RT-qPCR(IU/ml)测量HEV RNA水平。所提供的数据是重复进行的两个独立实验的平均值。(d日)一份细胞内病毒颗粒被用来感染幼稚的Huh。用免疫荧光法分析7.5细胞ORF2蛋白的表达。确定了焦点形成单位(FFU),结果以FFU/mL表示。所示数据是两个独立实验的平均值,共进行了三次。
图7
图7
ORF2蛋白N-糖基化位点突变对颗粒密度的影响。将浓缩的wt和mt PLC3/HEV细胞上清液分层于碘xanol梯度上并超速离心。收集了12个馏分,并测量了它们的密度。WB使用1E6抗体分析ORF2的表达。星号表示ORF2i蛋白。通过RT-qPCR定量每个组分中的HEV RNA水平。为了清晰和简洁起见,删掉了污点。补充图6显示了全长印迹。

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