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.2019年4月；54(4):1282-1294.
doi:10.3892/ijo.2019.4715。 Epub 2019年2月13日。

miR‑300通过靶向淋巴增强因子-1调节肝癌细胞的增殖和转移

陈玉佛 # 1, 郭元元 # 2, 李亚伟 1, 杨静文 1, 刘静（音译） 1, 吴琼 1, 王瑞（Rui Wang） 1
附属公司

miR‑300通过靶向淋巴增强因子-1调节肝癌细胞的增殖和转移

陈玉佛等。 国际癌症杂志. 2019年4月.

摘要

越来越多的证据表明，microRNAs（miRNAs）在肝细胞癌（HCC）的细胞增殖和转移中起着关键作用。然而，miR‑300对肝癌的发展和进展的影响尚不清楚。在本研究中，与正常肝细胞相比，肝癌细胞系中miRNA（miR）‑300的表达显著降低。此外，我们分别采用MTT、集落形成分析、伤口愈合、Transwell分析和流式细胞术方法检测了miR‑300对细胞增殖和凋亡、细胞周期、迁移和侵袭的影响。结果表明，miR‑300过表达抑制Huh‑7细胞的增殖、诱导凋亡和G1/S细胞周期阻滞，并抑制迁移和侵袭，而miR−300沉默促进Hep3B细胞的增殖，迁移和侵袭。转录因子淋巴增强因子结合因子1（LEF‑1）被证实为miR‑300的直接靶基因，在机制上促进了细胞增殖、迁移和侵袭，并介导了miR-300对肝癌细胞的影响。此外，发现肝癌组织中miR‑300的低表达和LEF‑1的高表达与肝癌患者预后不良有关。这些发现表明，miR-300可能是HCC患者的潜在预后预测因子和治疗靶点。

关键词：肝细胞癌；microRNA-300；淋巴增强因子1；增殖；细胞凋亡；入侵。

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数字

图1
图1
miR-300抑制肝癌细胞的增殖，诱导凋亡和细胞周期阻滞。（A） 采用RT-qPCR方法检测肝癌细胞株Huh-7、Li-7、Hep3B和SNU-449以及正常肝细胞株L02（n=3；**与L02相比P<0.01）。（B） 分别用miR-300模拟物（miR-300）或miR-300抑制剂转染Huh-7或Hep3B细胞（n=3；**与对照组相比P<0.01）。（C） MTT法检测转染miR-300模拟物（miR-300）或miR-300抑制剂（n=3；*P<0.05，**与对照组相比P<0.01）。（D） 用集落形成试验评价集落形成能力；显示了具有代表性的图像。（E） 通过流式细胞术分析检测用miR-300模拟物（miR-300）或miR-300抑制剂转染后Huh-7和Hep3B细胞系的凋亡率（n＝3；**与对照组相比P<0.01）。（F） 用流式细胞术分析转染miR-300模拟物（miR-300）或miR-300抑制剂的Huh-7和Hep3B细胞的DNA含量，并计算细胞周期G0/G1、S和G2/M期的细胞百分比（n=3；**与对照组相比P<0.01）。HCC，肝细胞癌；RT-qPCR、逆转录定量聚合酶链反应；miR，microRNA；OD，光密度；7-AAD，7-氨基放线菌素D；PE，藻红蛋白。
图2
图2
miR-300抑制肝细胞癌细胞的迁移、侵袭和EMT。（A） 在Huh-7和Hep3B细胞中用miR-300模拟物（miR-300）或miR-300抑制剂转染后24小时，进行伤口愈合测定以观察细胞迁移能力。显示了具有代表性的图像。比例尺，200µm（B）采用Transwell迁移实验和Transwell Matrigel侵袭实验检测转染miR-300模拟物（miR-300）或miR-300抑制剂的Huh-7和Hep3B细胞的迁移和侵袭能力。显示了具有代表性的图像。比例尺，50µm.（C）使用western blot分析在转染miR-300模拟物（miR-300）或miR-300抑制剂的Huh-7和Hep3B细胞中检测EMT标记物E-cadherin和vimentin的蛋白表达。（D） 使用逆转录定量聚合酶链反应检测转染miR-300模拟物（miR-300）或miR-300抑制剂的Huh-7和Hep3B细胞中EMT标记物E-cadherin和vimentin的mRNA表达。（n=3；*P<0.05，**P<0.01）。上皮-间充质转化；miR，microRNA。
图3
图3
在肝细胞癌中，miR-300直接靶向LEF-1。（A） 对miR-300进行生物信息学分析，预测LEF-1编码序列3′UTR中的结合位点。（B） 用miR-300模拟物（miR-300）或miR-300抑制剂转染Huh7和Hep3B细胞后48小时进行荧光报告分析。（n=3；**P<0.01）。（C） 在转染miR-300模拟物（miR-300）或miR-300抑制剂后48小时检测Huh-7和Hep3B中LEF-1的蛋白水平。（D） 用miR-300模拟物（miR-300）或miR-300抑制剂转染Huh-7和Hep3B后48小时LEF-1的mRNA水平。（n=3；*P<0.05，**与对照组相比P<0.01）。LEF-1，淋巴增强因子结合因子1；3′UTR，3′非翻译区；miR，microRNA；WT，野生型；哑巴，突变体。
图4
图4
LEF-1增强肝癌细胞的细胞增殖，抑制凋亡和细胞周期阻滞。（A） Western blotting检测LEF-1蛋白在HCC细胞株Huh-7、Li-7、Hep3B和SNU-449以及正常肝细胞株L02中的表达。（B） 用RT-qPCR检测肝癌细胞株Huh-7、Li-7、Hep3B和SUN-449以及正常肝细胞株L02（n=3；**P<0.01，***与L02相比，P<0.001）。（C） 用western blotting和RT-qPCR分析分别评估转染LV-LEF-1的Huh-7细胞中LEF-1的蛋白和mRNA表达（n=3；***与对照组相比P<0.001）。（D） 用western blotting和RT-qPCR分析分别检测了三种LEF-1 shRNAs转染Hep3B细胞中LEF-1的蛋白和mRNA表达（n=3；***与对照组相比P<0.001）。（E） MTT法检测用LV-LEF-1转染的Huh-7细胞和用LEF-1 shRNA转染的Hep3B细胞的增殖（n＝3；*P<0.05，**与对照组相比P<0.01）。（F） 用集落形成试验评估克隆形成能力。显示了具有代表性的图像。（G） 流式细胞术检测LV-LEF-1和LEF-1 shRNA转染Huh-7和Hep3B细胞后的凋亡率（n=3；**与对照组相比P<0.01）。（H） 用流式细胞仪分析转染LV-LEF-1或LEF-1 shRNA的Huh-7和Hep3B细胞的DNA含量，并计算细胞周期G0/G1、S和G2/M期的细胞百分比（n=3；**P<0.01）。HCC，肝细胞癌；RT-qPCR、逆转录定量聚合酶链反应；LEF-1，淋巴增强因子结合因子1；LV，慢病毒；shRNA，短发夹RNA:7-AAD，7-氨基放线菌素D；PE，藻红蛋白。
图5
图5
LEF-1促进肝细胞癌细胞的迁移、侵袭和上皮-间充质转化。（A） 伤口愈合实验观察转染LV-LEF-1或LEF-1 shRNA后24 h Huh-7和Hep3B细胞的细胞迁移能力。显示了具有代表性的图像。比例尺，200µm.（B）采用Transwell迁移实验和Transwell Matrigel侵袭实验检测转染LV-LEF-1或LEF-1 shRNA后Huh-7和Hep3B细胞的迁移和侵袭能力。比例尺，50µm.（C）用LV-LEF-1或LEF-1 shRNA转染Huh-7和Hep3B细胞后，用western blot分析检测E-cadherin和vimentin的蛋白表达。（D） 采用逆转录定量聚合酶链反应检测LV-LEF-1或LEF-1 shRNA转染后Huh-7和Hep3B细胞中E-cadherin和vimentin的mRNA表达。（n=3；*P<0.05，**与对照组相比P<0.01）。LV，慢病毒；LEF-1，淋巴增强因子结合因子1；短发夹RNA。
图6
图6
miR-300通过调节肝细胞癌细胞中LEF-1的表达，影响细胞增殖、凋亡和细胞周期。（A） MTT法检测联合转染LEF-1载体（LEF-1）和miR-300模拟物（miR-300）的Huh-7细胞以及联合转染LEF-1 shRNA和miR-30抑制剂的Hep3B细胞（n=3；*P<0.05，**与对照组相比P<0.01）。（B） 用集落形成试验评估克隆形成能力。显示了具有代表性的图像。（C） 联合转染LEF-1载体、miR-300/LEF-1 shRNA和miR-300抑制剂（n=3；*P<0.05，**P<0.01）。（D） 用流式细胞仪分析DNA含量，计算细胞周期G0/G1、S和G2/M期细胞百分比（n=3；*P＜0.05，**P<0.01）。OD，光密度；miR，microRNA；LEF-1，淋巴增强因子结合因子1；短发夹RNA；7-AAD，7-氨基放线菌素D；PE，藻红蛋白。
图7
图7
miR-300通过调节肝细胞癌细胞中LEF-1的表达，影响肝细胞的迁移、侵袭和上皮-间质转化。（A） 用LEF-1载体和miR-300模拟物（Huh-7细胞）或LEF-1 shRNA和miR-30抑制剂（Hep3B细胞）共转染24 h后，进行伤口愈合试验，观察细胞迁移能力。显示了具有代表性的图像。比例尺，200µm。（B）进行Transwell迁移和Transwell基质凝胶入侵测定以检查细胞迁移和入侵能力。显示了具有代表性的图像。比例尺，50µm.（C）用western blot分析检测E-cadherin和vimentin的蛋白表达。（D） 采用逆转录定量聚合酶链反应检测LEF-1和miR-300共转染Huh-7细胞和LEF-1 shRNA和miR-30抑制剂共转染Hep3B细胞后E-cadherin和vimentin的mRNA表达（n=3；*P<0.05，**P<0.01）。miR，microRNA；LEF-1，淋巴增强因子结合因子1；短发夹RNA。
图8
图8
肝癌组织中miR-300下调，LEF-1上调。采用逆转录定量聚合酶链反应检测肝癌组织（n=62）和非肿瘤肝组织（n=24；**P<0.01）。（C） 肝癌患者LEF-1的表达与miR-300的表达呈负相关。Kaplan-Meier生存分析用于评估肝癌患者（n=62）中（D）miR-300和（E）LEF-1的表达与总生存率之间的关系。描绘了miR-300和LEF-1低表达和高表达患者的生存曲线。HCC，肝细胞癌；miR，microRNA；LEF-1，淋巴增强因子结合因子1。
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