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.2019年4月9日；10(1):1629.
doi:10.1038/s41467-019-09549-4。

流感病毒核糖核蛋白在内质网出口形成液体细胞器

玛塔·阿伦克尔 1, 西尔维亚山谷-科斯塔 1, Temitope Akhigbe Etibor公司 1, 菲利佩·费雷拉 1, 安娜·劳拉·索萨 1 2, 玛丽亚·若昂·阿莫林 3
附属公司

流感病毒核糖核蛋白在内质网出口形成液体细胞器

玛塔·阿伦克尔等。 国家公社. .

摘要

甲型流感病毒有一个八部分的RNA基因组，在病毒组装过程中形成一个包含每个RNA一个拷贝的复合体。基因组组装是一个由RNA-RNA相互作用驱动的选择性过程，据推测会导致分散在胞质溶胶中的离散点状结构。这里，我们表明，与公认的观点相反，这些结构的形成先于不同病毒核糖核蛋白（vRNP）之间的RNA-RNA相互作用，因为它们在只表达一种vRNP类型的细胞中聚集。我们证明，这些病毒包涵体显示出液体细胞器的特征，在没有分隔膜的情况下与细胞液分离，动态交换物质并快速适应环境变化。我们提供证据表明，病毒包涵体靠近内质网（ER）出口部位发育，依赖于持续的ER-Golgi囊泡循环，并且不促进向干扰素反应的逃逸。我们建议病毒内含物将vRNP从细胞溶质中分离出来，并在液体环境中促进选择性RNA-RNA相互作用。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
病毒内含物是在没有片段间RNA-RNA相互作用的情况下形成的。293 T细胞转染16 h含有流感vRNP的最低蛋白成分：三种聚合酶蛋白（3P）（或作为非功能性对照，两种缺乏PB2-2P的聚合酶蛋白质）和NP，以及表达GFP-NP和一一个荧光素酶报告质粒，以负义克隆，两侧为流感启动子。如有指示，也使用mCherry-NP代替GFP-NP。测定荧光素酶表达的发光度，并将数值绘制为平均值 ± 平均值标准误差（SEM）。结果是两个独立实验的集合；或b条–e（电子）293 T细胞进一步转染表达来自片段7和8或片段7的vRNA的质粒，以及当片段7单独表达时编码NS2的质粒。b条对细胞进行裂解，并通过western blotting检测所示蛋白。c（c）固定细胞并对Rab11进行染色（红色）。白色方框显示NP和Rab11之间的共同定位区域。核用黄色虚线表示。酒吧 = 10 微米。d日三个区域类别内Rab11夹杂物的频率分布（单位：μm2)为每个条件绘制。使用非参数Kruskal–Wallis检验和Dunn多重比较检验对数据进行统计分析(***第页 < 0.001). 在每种条件下分析30到70个细胞，并进行3个独立实验。e（电子）对重复样品进行处理，以通过FISH检测第7段（红色）和第8段（灰色）RNA。白色方框显示NP和病毒片段之间的共同定位区域。核用黄色虚线表示。酒吧 = 10 微米
图2
图2
PA-GFP病毒和GFP-NP/PR8系统形成动态细胞溶质病毒内含物。一当MOI为0.001时，用编码PR8病毒或WT病毒的PA-GFP感染A549细胞，以跟踪其生长超过48 h进行多周期分析。b条用编码mCherry-NP的质粒转染A549细胞，并在MOI为5时与PA-GFP病毒共同感染16 h、 和现场损坏。图像是从补充电影1中提取的。c（c）–克A549细胞感染PR8 WT病毒、PA-GFP病毒，或转染编码GFP-NP或GFP的质粒，并与PR8病毒共同感染，MOI为5，持续16个月 小时。c（c）固定细胞，进行FISH处理以检测片段1和3，并成像。在左上角的图中，细胞也进行了NP染色（绿色）。每个条件下，从2个独立实验中至少分析30个细胞。d日–克细胞在延时条件下成像。单个帧显示PA-GFP病毒的融合/裂变事件(d日,（f）)或GFP-NP/PR8系统(e（电子）,克)在缺席的情况下(d日,e（电子）)或细胞骨架药物诺可唑和latrunculin A的存在(（f）,克). 诺卡唑和latrunculin A在4时添加 h.p.i.黄色箭头突出显示聚变或裂变运动。图像是从补充电影2到9中提取的。酒吧 = 2 微米。每种情况下至少分析了来自3个独立实验的30个细胞
图3
图3
病毒内含物对细胞环境的变化迅速作出反应。用编码GFP-NP的质粒转染A549细胞并感染PR8(一)或感染PA-GFP病毒(b条)MOI为5。在10–16 hpi时，在延时条件下对细胞成像。黑色箭头表示添加了80%的水（低渗休克）、5%的己二醇或常规培养基。白色方框突出显示单个框架中细胞质中的病毒内含物。白色虚线表示细胞核，黄色虚线表示细胞外围。酒吧 = 10 微米。图像是从补充电影10到15中提取的。实验至少进行了两次。c（c）A549细胞感染PR8、PA-GFP病毒，或转染编码GFP-NP的质粒并感染PR8。16岁 对hpi、细胞进行固定并对其进行NP染色。计算并绘制指定处理下含有未溶解病毒包涵体的细胞百分比。使用非参数Kruskal–Wallis检验和Dunn多重比较检验对数据进行统计分析(**第页 < 0.05; ***第页 < 0.001). 每个点至少分析10个细胞，每个条件分析10个面板
图4
图4
vRNP/Rab11内含物动态交换物质，形成无膜液体细胞器。用编码GFP-NP的质粒转染A549细胞并感染PR8病毒，MOI为5，持续10–16 h、 并在延时条件下成像。一显示了一个具有代表性的单元格。该细胞中病毒包涵体的荧光信号描述为：平均强度（红色）、标准偏差（绿色）、两者的合并以及变异系数。选择两个病毒NP内含物区域，在紫色和青色方框中突出显示，用于光漂白后的荧光恢复（FRAP）。酒吧 = 10 微米。b条光漂白区域用黄色圆圈标记。黑色箭头表示光漂白的时间。绘制了每个颗粒的相对荧光强度（R.F.I.）作为时间的函数。图像是从补充电影16中提取的。c（c）将R.F.I.绘制为25个FRAP事件平均值的时间函数（左图）。平均值显示为（黑色），误差条表示标准偏差（灰色）。每个光漂白区域的回收率显示特定时间（右图），中间值用红色条表示。显示了代表两个独立实验的单个实验。d日具有GFP-NP/PR8系统的HeLa细胞，感染16 小时（MOI = 10） 用共焦显微镜和电子显微镜对其进行成像，并对所得图像进行叠加。相关区域（包裹体1至3）由上面板中的虚线描绘，下面板中显示了更详细的信息。表面萌芽的子代病毒（黑色箭头）表明该细胞受到感染。黑色分隔箭头显示包裹体中的单个小泡。e（电子）GFP-Rab11 WT细胞感染PR8病毒（MOI = 5） 用于16 h、 然后进行GFP染色（18 纳米金颗粒）和病毒NP（6 纳米金颗粒）。包含区域用黑框突出显示。黑色箭头表示病毒包涵体附近的内质网结构。黑色箭头显示子代病毒在细胞表面发芽。黑色分隔箭头显示气泡。白色箭头表示电子密度vRNP。显示了两个独立实验的单个实验代表
图5
图5
病毒内含物与内质网退出位点相关。一用mCherry-NP转染Sec61β-Emerald细胞并感染PR8病毒，MOI为10，持续16 小时。b条A549细胞与编码mCherry-NP和ER-GFP的质粒共转染，并感染PR8病毒，MOI为10，持续16 小时。一,b条细胞在延时条件下成像。显示了单个帧，其中单个移动粒子用黄色箭头高亮显示。图像是从补充电影17和18中提取的。在每种条件下，对来自3个独立实验的15个以上细胞进行分析。c（c）A549细胞被PR8病毒感染或模拟感染（M），MOI为3，并在指定时间固定。对细胞进行ER蛋白Sec31A（绿色）、PDI（灰色）和病毒NP蛋白（红色）染色。白色框突出显示的区域显示在每个面板的右侧。黄色箭头表示Sec31A和NP.Bar之间的共同定位 = 10 微米。对来自2个独立实验的30多个细胞进行了分析。d日用编码mCherry NP和GFP-Sec16的质粒共转染A549细胞，并用PR8病毒感染或模拟感染（M）16 h.细胞在延时条件下成像。代表性单元格显示在左侧的大图像中。小面板中显示了单独的帧，其中单个移动的粒子用黄色箭头高亮显示。提供了两个感染细胞的示例（16 h.1和16 h.2）。酒吧 = 7.5微米。图像是从补充电影19和20中提取的。图像代表至少15个细胞，来自2个独立实验
图6
图6
ER-Golgi贩运的中断分解了vRNP热点。A549细胞感染或模拟感染PR8病毒，MOI为3。一90岁时 最小p.i.，2 微克 毫升−1brefeldin A（BFA）或10 微克 毫升−1添加诺卡唑（NOC）并孵育10 h，直到收集上清液并测定病毒滴度，或通过western blotting检测细胞的Laemmli和NP水平。使用非参数单向方差分析对数据进行统计分析，然后进行Friedman的多重比较检验(*第页 < 0.05).b条–d日8点 hpi，细胞也用2 微克 毫升−11的BFA 小时。b条对细胞进行ER标记物PDI（绿色）、病毒蛋白NP（红色）和顺式-高尔基体标记物GM130（灰色）并通过共焦显微镜成像。细胞质的选定区域用白色方框标记，并显示在图像的左上角。酒吧 = 10 微米。c（c）三种尺寸类别内NP夹杂物的频率分布（单位：μm2)、每μm夹杂物数量2绘制了每种情况下包涵体内部NP染色的百分比。使用非参数Kruskal–Wallis检验和Dunn多重比较检验对数据进行统计分析(***第页 < 0.001). 对每个条件下两个独立实验的平均60个细胞进行分析。d日感染细胞被染上宿主蛋白Rab11（绿色）和病毒蛋白NP（红色）和M2（灰色）。细胞通过共焦显微镜成像。白色框高亮显示的区域显示在每个图像的右上角。e（电子）用编码GFP-NP的质粒转染A549细胞，并与PR8病毒共同感染，MOI为5，持续10 h.在无细胞或添加2后立即在延时条件下对细胞成像 微克 毫升−1博鳌亚洲论坛。酒吧 = 10 微米。图像是从补充电影20和21中提取的，是来自2个独立实验的9个视频的代表
图7
图7
内质网出口位点的破坏溶解病毒包涵体。用编码GFP、SAR1 WT-GFP（SAR1）或SAR1-GTP-GFP（SAR1-GTP）的质粒转染HeLa细胞，24 h后，感染或模拟感染PR8病毒，MOI为10。16岁 hpi，将细胞固定并进行免疫荧光处理。一对细胞进行病毒蛋白NP（红色）和ER蛋白PDI（灰色）染色。白色框突出显示的区域显示在每个面板的右侧。b条每μm夹杂物数量2、包裹体内部NP染色的百分比以及三个区域类别内NP包裹体的频率分布（单位：μm2)为每种情况绘制。使用非参数Kruskal–Wallis检验和Dunn多重比较检验对数据进行统计分析(***第页 < 0.001). 每个条件下分析来自两个独立实验的40多个细胞。c（c）感染细胞进行病毒蛋白HA染色，并通过共焦显微镜成像。酒吧 = 10 微米
图8
图8
干扰素反应不受病毒包涵体形成的影响。一表达GFP-Rab11 WT或GFP-Rap11 DN的稳定细胞系被PR8 WT或NS1-N81病毒感染或模拟感染（M），MOI为3。一细胞固定在8和16 hpi和NP染色（红色）。酒吧 = 10 微米。b条三个区域类别内NP夹杂物的频率分布（单位：μm2)为每个细胞系绘制。使用非参数Kruskal–Wallis检验和Dunn多重比较检验对数据进行统计分析(***第页 < GFP-Rab11 WT细胞为0.001；GFP-Rab11 DN细胞无统计学意义）。统计分析比较了不同条件下所有夹杂物的面积。每个条件下平均分析30个细胞。显示了两个独立实验的单个实验代表。c（c）通过RT-qPCR在转录水平上评估与GAPDH相关的IFN-β、IFN-α、IL-29和viperin的表达。Poly（I:C）被用作这些转录物最大表达的阳性对照。使用双向ANOVA检验对数据进行统计分析，然后进行Sidak多重比较检验（未发现条件之间的统计显著性）。数据表示三个独立实验的平均值。d日磷酸化IRF3、GFP、NP、NS1和GAPDH的表达在蛋白质水平上通过western blotting进行评估。e（电子）24小时时，用ELISA法测定细胞上清液中分泌的干扰素-β水平 马力。Poly（I:C）被用作IFN-β蛋白最大表达的阳性对照。该方法的检测限为30 前列腺素 毫升−1（虚线）。使用双向ANOVA检验对数据进行统计分析，然后进行Sidak多重比较检验（未发现条件之间的统计学显著性）。数据表示三个独立实验的平均值。（f）在指定的时间，收集上清液，并使用MDCK细胞通过斑块分析评估病毒生成。使用Holm–Sidak多重比较测试对数据进行统计分析(**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001). 数据对应于三个独立实验中的一个代表性实验
图9
图9
在共同感染中，病毒内含物携带两种亲本病毒的vRNP。A549细胞被模拟感染或感染PR8和/或Eng2009，MOI分别为3。16岁 将hpi、细胞固定并进行FISH处理，以检测两种病毒的第4段和PR8的第6段。在共感染中，所有片段共定位，在PR8攻击中，片段4和6的入口显示放大。每种情况分析10个细胞
图10
图10
拟议模型。病毒包涵体（红色）具有液体细胞器的特性，在没有分隔膜的情况下与细胞质分离。病毒包裹体动态交换材料（1），容易变形，表现出裂变（2）和聚变（3）事件。病毒包裹体可以分别在聚变/裂变事件之前和之后传播很长距离（4）。这些细胞器形成于ERES附近（蓝色），其组装依赖于连续的ER-Golgi囊泡循环。我们认为病毒包涵体触发八个不同片段之间vRNP–vRNP相互作用的成核，以组装完整的IAV基因组。入口显示靠近ERES的病毒内含物组成。它们包含所有类型的vRNP，Rab11和宿主膜聚集在一起，但不由脂质双层分隔
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