CRISP-R/Cas9 Mediated Deletion of Copper Transport Genes CTR1 and DMT1 in NSCLC Cell Line H1299. Biological and Pharmacological Consequences

doi:10.3390/cells8040322

.2019年4月6日；8(4):322.

doi:10.3390/细胞8040322。

CRISP-R/Cas9介导非小细胞肺癌H1299细胞铜转运基因CTR1和DMT1的缺失。生物和药理学后果

叶卡捷琳娜·伊列乔娃^1 2 三, 伊丽莎·博纳尔迪⁴, Iurii A奥尔洛夫⁵, 叶卡捷琳娜A Skomorokhova⁶, 卢德米拉五世普契科娃^7 8 9, 马西莫·布罗吉尼^10 11

附属公司

¹ITMO大学微量元素代谢实验室，Kronverksky。俄罗斯圣彼得堡，邮编：49197101。ikaterina2705@yandex.ru。
²美国科学院实验医学研究所分子遗传学系。巴甫洛夫街12号，197376圣彼得堡，俄罗斯。ikaterina2705@yandex.ru。
^三俄罗斯圣彼得堡Politektechnicheskaya街29号彼得大圣彼得堡理工大学生物物理系，195251。ikaterina2705@yandex.ru。
⁴分子药理学实验室，“Mario Negri”，IRCCS，Via La Masa 19，20156 Milan，Italy。eli.bon89@gmail.com。
⁵ITMO大学微量元素代谢实验室，Kronverksky av。1971年9月49日，俄罗斯圣彼得堡。orlov239@gmail.com。
⁶ITMO大学微量元素代谢实验室，Kronverksky av。俄罗斯圣彼得堡，邮编：49197101。katjaskom@yandex.ru。
⁷ITMO大学微量元素代谢实验室，Kronverksky av。俄罗斯圣彼得堡，邮编：49197101。puchkovalv@yandex.ru。
⁸美国科学院实验医学研究所分子遗传学系。巴甫洛夫街12号，197376圣彼得堡，俄罗斯。puchkovalv@yandex.ru。
⁹俄罗斯圣彼得堡Politektechnicheskaya街29号彼得大圣彼得堡理工大学生物物理系，195251。puchkovalv@yandex.ru。
¹⁰ITMO大学微量元素代谢实验室，Kronverksky av。俄罗斯圣彼得堡，邮编：49197101。massimo.broggini@marionegri.it。
¹¹分子药理学实验室，Istituto di Ricerche Farmacologische“Mario Negri”，IRCCS，Via La Masa 192015，意大利米兰。massimo.broggini@marionegri.it。

PMID： 30959888
预防性维修识别码： PMC6523758型
内政部： 10.3390/单元8040322

CRISP-R/Cas9介导非小细胞肺癌H1299细胞铜转运基因CTR1和DMT1的缺失。生物和药理学后果

叶卡捷琳娜·伊列乔娃等。细胞. 2019.

.2019年4月6日；8(4):322.

doi:10.3390/cells8040322。

作者

叶卡捷琳娜·伊列乔娃^1 2 三, 伊丽莎·博纳尔迪⁴, 尤里·A·奥尔洛夫⁵, 叶卡捷琳娜A Skomorokhova⁶, 卢德米拉五世普契科娃^7 8 9, 马西莫·布罗吉尼^10 11

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¹ITMO大学微量元素代谢实验室，Kronverksky av。俄罗斯圣彼得堡，邮编：49197101。ikaterina2705@yandex.ru。
²美国科学院实验医学研究所分子遗传学系。巴甫洛夫大街12号，197376年，俄罗斯圣彼得堡。ikaterina2705@yandex.ru。
^三俄罗斯圣彼得堡Politektechnicheskaya街29号彼得大圣彼得堡理工大学生物物理系，195251。ikaterina2705@yandex.ru。
⁴分子药理学实验室，“Mario Negri”，IRCCS，Via La Masa 19，20156 Milan，Italy。eli.bon89@gmail.com。
⁵ITMO大学微量元素代谢实验室，Kronverksky av。俄罗斯圣彼得堡，邮编：49197101。orlov239@gmail.com。
⁶ITMO大学微量元素代谢实验室，Kronverksky av。俄罗斯圣彼得堡，邮编：49197101。katjaskom@yandex.ru。
⁷ITMO大学微量元素代谢实验室，Kronverksky av。俄罗斯圣彼得堡，邮编：49197101。puchkovalv@yandex.ru。
⁸美国科学院实验医学研究所分子遗传学系。巴甫洛夫街12号，197376圣彼得堡，俄罗斯。puchkovalv@yandex.ru。
⁹俄罗斯圣彼得堡Politektechnicheskaya街29号彼得大圣彼得堡理工大学生物物理系，195251。puchkovalv@yandex.ru。
¹⁰ITMO大学微量元素代谢实验室，Kronverksky av。俄罗斯圣彼得堡，邮编：49197101。massimo.broggini@marionegri.it。
¹¹分子药理学实验室，“Mario Negri”，IRCCS，Via La Masa 19，20156 Milan，Italy。massimo.broggini@marionegri.it。

PMID： 30959888
预防性维修识别码： PMC6523758型
内政部： 10.3390/细胞8400322

摘要

铜是一种剧毒的微量营养素，它起着两个重要作用：它是铜依赖酶的催化和结构辅因子，并且充当第二信使。在细胞中，铜由CTR1（高亲和性铜转运蛋白1）、跨膜高亲和力铜转运蛋白和DMT1（二价金属转运蛋白）导入。在细胞溶质中，酶特异性伴侣从CTR1的C末端接收铜并将其传递到其脱辅基酶。DMT1不能作为催化铜的供体，因为它没有一个细胞溶质结构域，而这是铜转移到协助铜酶形成的Cu-caperon所必需的。这里，我们假设DMT1可以调节监管铜池所需的铜方式。为了验证这个假设，我们使用CRISPR/Cas9生成H1299细胞系CTR1号机组或DMT1型单次击倒（KO）和CTR1号机组/DMT1型双淘汰赛（DKO）。为了确认基因的KOs，我们使用了qRT-PCR。为每个基因选择两个独立的克隆进行进一步的研究。在CTR1 KO细胞中DMT1型基因显著增加，反之亦然。在衍生细胞的亚细胞隔室中，铜浓度下降，但细胞核中铜的基础水平没有显著变化。CTR1 KO细胞（而非DMT1 KO）对顺铂和银离子（通过CTR1进入细胞的试剂）的敏感性降低。使用单个CTR1和DMT1-KO，我们能够证明CTR1与DMT1都能形成重要的细胞内铜酶（SOD1，COX），但不能形成分泌性铜蓝蛋白。CTR1的缺失导致COMMD1、XIAP和NF-κB的水平降低。不同的是，DMT1缺乏诱导了COMMD1、HIF1α和XIAP水平的增加。讨论了利用CTR1 KO和DMT1 KO细胞研究铜选择性催化和信号传递的动态平衡的可能性。

关键词：CRISPR-Cas9；顺铂；铜动态平衡；铜进口商CTR1和DMT1；铜酶；信号；银色。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。资助者在研究设计中没有任何作用；在数据的收集、分析或解释中。，在撰写手稿时，或在决定公布结果时。

数字

图1
通过qRT-PCR对亲本H1299细胞中CTR1、DMT1和CTR2的表达进行评估，其中一个克隆KO用于CTR1（克隆45），一个克隆KO用于DMT1（克隆31），克隆*CTR1号机组*^−/−,*DMT1型*^+/−（DKO2）和克隆*CTR1号机组*^−/−,*DMT1型*^−/−（DKO1）。Y轴：肌动蛋白上的mRNA折叠。

图2
铜在CTR1 KO、DMT1 KO和DKO细胞中的分布。Y轴：亚细胞组分中的铜浓度（µg/L）。下面是带有Cox4抗体的WB。线路：1、H1299 2、CTR1 KO；3、DMT1 KO；4，DKO。每个样品含有30µg蛋白质。

图4
H1299、CTR1 KO、DMT1 KO和DKO细胞中的银分布。Y轴：亚细胞组分中的铜浓度（µg/L）。凝胶：从H1299细胞分离的亚细胞组分中的mtDNA特异性PCR产物。1、细胞核；2，MSN；线粒体；4、ICM。样品中含有10µ蛋白质。

图5
来自H1299的KO细胞中CCS和SOD1基因的表达。Y轴：mRNA水平（折叠肌动蛋白）*第页与H1299相比<0.05。Y轴：mRNA折叠变化。插入：SOD1的WB。1、H1299；2、CTR1 KO；3、DMT1 KO；4，DKO。每个样品含有30µg蛋白质。

图6
H1299衍生KO细胞中铜蓝蛋白基因活性。(A类)人血清，0.025µL/线，凝胶染色*波尔图*-二茴香胺(B类)具有人铜蓝蛋白抗体的白细胞：1，人血清，0.01µL/株；2、H1299；3、CTR1 KO45；4，CTR1-KO46；5、DMT1 KO31；6、DMT1 KO20；7、DKO1；8、DKO2；每行25µL介质。蛋白质在不含SDS的8%PAG中通过电泳分离。

图7
qRT-PCR分析成熟mRNA的浓度，成熟mRNA是与不同H1299衍生克隆中铜调节作用相关的基因的产物。Y轴：mRNA水平，a.u.（折叠肌动蛋白）*第页与H1299相比<0.05。(**插入件**)WB分析：COMMD1，每个样品含有80µg蛋白质。HIF1α，每个样品含有50µg蛋白质和NF-κB（第65页），每个样品含有50µg蛋白质。WB:1，H1299；2、CTR1 KO；3、DMT1 KO；4，伏特加。

图8
顺铂和卡铂在H1299亲代细胞和KO衍生细胞中的细胞毒性活性。X轴：药物浓度。Y轴：增长率。使用MTS试验测定生长抑制活性。每个点代表六个重复的平均值±SD。

图9
VE-822、Torin-1、二甲双胍和STF-3在H1299亲代细胞和KO衍生细胞中的细胞毒性活性。X轴：药物浓度。Y轴：增长率。使用MTS试验测定生长抑制活性。每个点代表六个重复的平均值±SD。

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1. Ridge P.G.，Zhang Y.，Gladyshev V.N.铜转运蛋白和铜蛋白组的比较基因组分析揭示了铜利用的进化动力学及其与氧的联系。《公共科学图书馆·综合》。2008;3:e1378。doi:10.1371/journal.pone.0001378。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
1. Li S.，Zhang J.，Yang H.，Wu C.，Dang X.，Liu Y.铜缺乏通过下调HIF-1和抑制蜗牛/扭体介导的上皮-间充质转化抑制CoCl2诱导的MCF-7细胞侵袭性表型。科学。2015年报告；5:12410. doi:10.1038/srep12410。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
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