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.2019年4月5:8:e42434。
doi:10.7554/eLife.42434。

早期小鼠胚胎胚外和胚胎区中胚层迁移的不同表型

附属公司

早期小鼠胚胎胚外和胚胎区中胚层迁移的不同表型

贝查拉·萨卡利等。 埃利夫. .

摘要

在小鼠胚胎原肠胚形成过程中,外胚层细胞在原始条纹处分层,通过上皮-间充质转变形成中胚层和最终内胚层。新生中胚层中膜报告子的镶嵌表达使得能够通过实时成像记录细胞形状和轨迹。离开条纹后,细胞改变了形状,并根据相邻的胚层和胚胎区域,伸出不同大小和丰度的突起。胚胎轨迹曲折但有方向性,而胚外中胚层细胞几乎没有净位移。胚胎和胚外中胚层转录体强调了不同的导向、细胞骨架、粘附和细胞外基质特征。具体而言,中间丝在胚外中胚层中高度表达,而F-actin的实时成像显示,仅在胚胎中胚层有丰富的肌动蛋白丝。因此,罗亚种族1中胚层的条件缺失抑制胚胎,但不抑制胚外中胚层迁移。总的来说,这表明单独的细胞骨架调控与中胚层亚群的形态和迁移相协调。

关键词:RhoGTPases;细胞迁移;细胞骨架;发育生物学;胚外;原肠胚形成;实时成像;鼠标。

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数字

图1。
图1新生中胚层的镶嵌膜GFP标记允许通过胚胎活体成像跟踪单个细胞迁移。
()后视图。上图:3D方案,中胚层为绿色,其余胚胎为灰色。虚线分隔胚胎和胚外区域。中间:双光子堆栈的Z投影。底部:高亮显示原始条纹的光学切片。(b条)侧视图,左前方。顶部:2D方案。中间:双光子堆栈的Z投影,显示细胞从后向前进展。底部:矢状光学切片。(c(c))前视图。顶部:3D方案。中间:双光子叠加的Z投影,大多数前细胞到达中线。底部:光学切片放大到向中线延伸的丝状体上。所有胚胎在E7.25时解剖,处于晚条纹/早芽阶段。VE:内脏内胚层;mG:膜绿色荧光蛋白,绿色;mT:膜dt番茄,灰色;EB:早期预算;LS:晚连胜;0B:零预算。(比例尺:50μm)。
图1——图补充1。
图1-图补充1.的实时成像Brachyury(T)公司-Cre;mTmG胚胎。
()显示小鼠胚胎解剖标志的草图,用于在早条纹期和早芽期之间进行分期。(b条)胚胎和胚胎外中胚层细胞分裂事件的量化(平均值±SEM,n=4个胚胎,p=0.0286,图1-图补充1-来源数据1.)。在平均360分钟内观察到细胞。未考虑靠近胚胎/胚外界面迁移的细胞。(c(c))在E6.75(早期条纹阶段,左图)解剖的胚胎体外生长,使用共焦成像进行12小时成像,再加上12小时的后续培养(零芽阶段,右图)。()8小时双光子成像后,在E7.25(晚条纹期,左图)解剖的胚胎体外生长(早芽期,右图)。(e(电子))E7.5原始条纹水平的横截面(条纹晚期)T型-Cre;mTmG胚胎F-actin染色(磷脂,红色)和细胞核染色(DAPI,蓝色)(比例尺:50μm)。((f))在原肠胚形成的不同阶段:E7(条纹中期)和E7.5(早期萌芽期)(平均值±SEM,n=5个胚胎,每个阶段)前、后和外侧象限中胚层(在外胚层和内脏内胚层之间解剖确定)中GFP+细胞/所有细胞的比率对嵌合体进行量化。使用Mann–Whitney–Wilcoxon计算P值。A: 前,P:后,Pr:近端,Di:远端,mGFP:膜GFP,绿色。
图2。
图2胚胎和胚外中胚层种群具有不同的形态和迁移模式。
()共焦叠加的Z投影T型-cre;mTmG胚胎于E6.75(早期条纹)解剖,细胞迁移追踪120分钟。左前方。白线标记胚胎/胚外边界。(比例尺:50μm)。(a’)胚胎(黑色,4个早/中期条纹胚胎中的n=34)和胚外(灰色,n=17个细胞)中胚层细胞的行程和净位移(左侧)以及路径直线度(右侧,0到1)的量化(平均值±SEM)。数据见表1和图2源数据1。(b条)胚胎和胚胎外中胚层细胞形状(从4个晚期条纹胚胎中提取的图像)(双光子堆叠的Z投影,比例尺:10μm)。(b’)左:2D内椭圆的长轴/短轴比率,作为细胞拉伸的量化(平均值±SEM,n=85个黑色胚胎细胞,n=83个灰色胚胎外细胞,8个中条纹至零芽期胚胎)。右:定量(平均值±SEM)胚胎(黑色,5个中条纹至早芽期胚胎中的167个细胞)和胚外(灰色,n=28个细胞)中胚层细胞中每个时间点每个细胞的丝状体数量。数据可以在表2、图2中找到,源数据2和3。使用Mann–Whitney–Wilcoxon计算P值。mG:膜GFP,绿色;mT:膜dt番茄,灰色。
图3。
图3迁移中胚层的细胞形状变化。
()中条纹胚胎原始条纹处新生中胚层分层的细胞形状进展(双光子叠加的Z投影,比例尺:10μm)。(b条)中胚层细胞向外胚层和内脏内胚层延伸丝状伪足(箭头)。胚胎处于晚条纹阶段。(双光子堆栈的Z投影,比例尺:10μm)。(b’)每个时间点每个细胞的丝足数量为平均值±SEM,n=4个晚期条纹胚胎中的40个细胞,p<0.0001。采用t检验计算P值。数据可以在图3源数据1中找到。(c(c))中胚层细胞(来自条纹中期胚胎)的蒙太奇,显示寻找行为(双光子堆栈的Z投影,比例尺:10μm)。()通过手动分割,中胚层细胞以红色、蓝色和黄色突出显示,以跟踪分裂后的细胞行为(来自中条纹期胚胎的共焦堆叠的Z投影,前视图,比例尺:50μm)。mG:膜GFP,绿色;mT:膜dt番茄,灰色。
图4。
图4中胚层种群的转录组确定了胚胎和胚外中胚层之间的差异。
()t-分布随机邻域嵌入(t-SNE)证实了E7(条纹中期)和E7.25(条纹晚期)相似生物样本的分组。EM:胚胎中胚层;EEM:胚外中胚层。更多示例信息可以在图4源数据1中找到。(b条)热图显示胚胎和胚外中胚层之间差异表达的基因,具有最高的统计意义。(c、 e(电子))胚胎中高表达基因的筛选(c(c))或胚胎外的(e(电子))中胚层,表示为E7时log2 fpkm的平均值±SEM(n=4个生物复制,p<0.01),胚胎为黑色,胚外为灰色。所有代表的基因也在E7.25显著差异调节。数据可以在图4中找到,源数据2和3。()零胚至早芽期胚胎矢状切面(左前方)的原位杂交,突出了埃帕4,Efa1公司,埃夫纳1Efna3号机组以红色圆点表示,位于后部。整个胚胎切片如图4补充图1所示。(比例尺:100μm)((f))早蕾期胚胎的矢状面(左前方)染色,检测血小板内皮细胞粘附分子1(左面板,Pecam-1为绿色,共焦叠加的Z投影)、波多卡利新(右面板,Podxl为绿色,光学切片)和F-actin(磷脂,灰色)。mGFP染色见图4补充图1中的同一部分。白线标记胚胎/胚外边界。(比例尺:50μm)。
图4——图补充1。
图4补充1。小鼠胚胎和胚外中胚层转录体。
(a和a')相关基因簇的基因本体丰富()生物过程和(a’)E7和E7.25胚胎外(顶部,灰色)或胚胎(底部,黑色)中胚层中高表达的细胞隔。(b、 c(c))选择已知在(b条)胚胎外或(c(c))胚胎中胚层,表示为E7时log2 fpkm的平均值±SEM(n=4个生物复制,p<0.001),胚胎为黑色,胚胎外为灰色。EM:胚胎中胚层和EEM:胚外中胚层。数据可以在图4中找到,源数据2和3。()早期芽期胚胎矢状切面(左前方)的光学切片,膜GFP为灰色,核为蓝色(DAPI)(比例尺:50μm)(e(电子))零芽期至早芽期胚胎突显转录本的矢状切面(左前方)原位杂交Epha4号机组,Efa1公司,埃夫纳1Efna3号机组,由红点表示(比例尺:100μm)。
图5。
图5胚胎和胚外中胚层细胞具有不同的细胞骨架组成。
()早期芽期胚胎矢状切面共焦叠加的Z投影,波形蛋白、F-肌动蛋白和细胞核(DAPI)染色。(b、 d日)Late Streak矢状截面共焦叠加的Z投影(b条)角蛋白8(灰色)和细胞核(DAPI,蓝色)染色的早期胚胎(c:20x,d:40x)。(e(电子))整个支架的双光子堆叠的Z投影T型-Cre;LifeAct-GFP(绿色)晚条纹胚胎。前部在左侧。(比例尺:50μm)。
图6。
图6。。罗亚种族1中胚层特异性突变体显示胚胎中胚层迁移受损。
()Z投影和(b条)野生型(WT)正面光学切片和罗亚Δ中胚层胚胎。虚线标记外胚层。(c(c))Z投影和()野生型和Rac1型Δ中胚层胚胎突出了原始条纹附近中胚层细胞的积累(*)。虚线标记外胚层。(e(电子))野生型和罗亚Δ中胚层胚胎(斜视前视图,右后,双光子)显示胚胎中胚层迁移受损,但胚胎外区域没有。((f))野生型和种族1Δ中胚层胚胎(前视图,共聚焦)显示胚胎中胚层迁移受损,而非胚外区域。每一个突变体都与一个方向相似的野生型同卵双胞胎进行比较。白线标记胚胎/胚外边界。mG:膜GFP,绿色;mT:膜dt番茄,灰色。(比例尺:50μm)。
图6——图补充1。
图6——图补充1……的表型种族1罗亚原肠胚形成后中胚层特异性突变体。
(a、 b条)的亮场(顶部)和mGFP外荧光(底部)图像罗亚Δ中胚层E8.5和E9.5的胚胎(c(c))原位杂交Brachyury公司在的E8.5罗阿Δ中胚层(顶部)和种族1Δ中胚层(底部)胚胎。(d、 e(电子))的亮场(顶部)和mGFP外荧光(底部)图像种族1Δ中胚层E8.5和E9.5的胚胎。所有突变体都与野生型同卵双胞胎进行比较。mGFP:膜GFP,灰色(比例尺:200μm)。((f))野生型(n=34)中胚层平均速度(m/min)(平均值±SEM,分别为p<0.014和p<0.0005),罗亚Δ中胚层(n=32),以及种族1Δ中胚层胚胎(左)和胚外(右)区域的(n=35)细胞。使用t检验计算P值。数据可以在图6中找到,图1补充了源数据1和2。
图6——图补充2。
图6-图补充2.手机详细信息罗亚种族1中胚层缺失的胚胎。
(a、 b条)胚胎中胚层外植体()mTmG;罗亚Δ中胚层、和(b条)mTmG;种族1Δ中胚层中/晚期条纹胚胎在纤连蛋白上培养()48小时和(b条)30小时,F-肌动蛋白(磷脂,红色)和细胞核(DAPI,蓝色)染色。mG:膜GFP,绿色。(n=3用于种族1,4用于罗亚; 2/3突变体的相似表型种族1和3/4个突变体罗亚). (比例尺:a为200μm,b为50μm)。(c(c))mTmG胚胎中胚层外植体的径向扩张;罗亚Δ中胚层胚胎,在纤维连接蛋白培养48小时后。解释图像被拟合在相应的圆圈内,并从中心以圆锥体的形式裁剪。(比例尺:100μm)。(c(c))野生型和罗亚Δ中胚层中胚层外植体。(n=野生型为250个细胞,野生型为272个细胞罗亚Δ中胚层,p<0.0001)。数据可以在图6中找到,图2补充了源数据1。()野生型双光子堆(左)和种族1Δ外胚层(右)在外胚层衍生中表达mGFP的胚胎(Sox2系统-Cre)细胞。前部在左侧。箭头指向胚胎外中胚层。虚线表示外胚层(比例尺:50μm)。(e、 (f))整体安装E8.5(e(电子))罗亚Δ中胚层以及((f))种族1Δ中胚层Pecam-1染色的胚胎(黄色,n=2罗阿,8用于种族1). 用虚线标记卵黄囊。(比例尺:100μm)。使用Mann–Whitney–Wilcoxon计算P值。所有突变体都与野生型同卵双胞胎进行比较。
图7。
图7胚胎和胚外中胚层细胞在小鼠胚胎原肠胚形成期间显示出不同的形状、轨迹、Rho-GTP酶依赖性和细胞骨架组成。
在胚外区域(顶部),中胚层细胞伸展,角蛋白8和波形蛋白丰度较高。它们的位移是复杂的,不依赖于Rho-GTP酶。在胚胎区域(底部),中胚层细胞致密,有许多丝状伪足,并且具有较高的F-actin丰度。细胞有更直的轨迹,需要Rho GTPases。胚胎方案代表一个左前方的矢状切面。绿色和灰色分别标记中胚层和其他层。

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