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.2019年6月12日；39（24）：4636-4656。
doi:10.1523/JNEUROSCI.0116-19.2019。 Epub 2019年4月4日。

线粒体氧化磷酸化需要PTCD1：可能与阿尔茨海默病的遗传关联

丹尼尔·弗莱克 1, 莉莲·福 2, 埃里克·韦尔舒伦（Erik Verschueren） 2, 特伦特·辛克 2, 迈克·雷切尔 三, 图沙·邦格尔 4, 本杰明·哈雷 5, 王渊源（音） 1, 罗伯特·格兰厄姆 4, 唐纳德·柯克帕特里克 2, 摩根盛 6, 巴里斯·宾格尔 6
附属公司

线粒体氧化磷酸化需要PTCD1：可能与阿尔茨海默病的遗传关联

丹尼尔·弗莱克等。 神经科学. .

摘要

除了淀粉样β斑块和tau缠结外，线粒体功能障碍也与阿尔茨海默病（AD）的病理学有关。神经元严重依赖线粒体功能，在AD早期发现大脑能量代谢缺陷；然而，线粒体参与AD发病机制的直接人类遗传证据有限。我们分析了4549例AD患者和3332例年龄匹配的对照组的全基因组测序数据，发现五肽重复序列蛋白1基因中罕见的蛋白质改变变体(PTCD1（PTCD1）)与对照组相比，病例中呈现富集趋势。我们在此表明，PTCD1是正常线粒体rRNA水平、线粒体核糖体正确组装以及线粒体翻译和电子传递链组装所必需的。PTCD1功能丧失会损害氧化磷酸化，并迫使细胞依赖糖酵解产生能量。表达PTCD1的AD-linked变体的细胞在代谢应激增加的情况下无法维持能量生产。在神经元中，PTCD1表达减少导致ATP水平降低，并影响自发的突触活动。因此，我们的研究揭示了线粒体功能和能量代谢所需的蛋白质与AD风险之间的可能联系。重要性声明线粒体是细胞能量的主要来源，线粒体功能障碍与阿尔茨海默病（AD）和其他神经退行性疾病的病理学有关。在这里，我们确定了基因中的一个变体PTCD1（PTCD1）这在AD患者中得到了丰富，并证明PTCD1是通过氧化磷酸化生成ATP所必需的。PTCD1调节线粒体核糖体骨架16S rRNA的水平，对线粒体翻译和电子传递链的组装至关重要。表达AD相关变体的细胞在代谢应激期间无法维持足够的ATP生成，PTCD1活性降低会破坏神经元能量稳态并抑制自发传递。我们的研究提供了线粒体功能所需蛋白质与遗传性AD风险之间的机制联系。

关键词：阿尔茨海默病；PTCD1；发电；线粒体；氧化磷酸化。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：在本研究过程中，所有作者均为罗氏集团成员Genentech的全职员工。

数字

图1。
图1。
R113W的标识PTCD1（PTCD1）作为变异体，晚发型AD风险增加，PTCD1 KO-HeLa细胞系生成增加。A类在三个独立队列的全基因组测序数据（顶部）和外显子组微阵列数据（底部，灰色）中R113W的AD关联结果。B类，不同物种R113上游和下游的PTCD1序列比对（Clustal Omega）。配色方案，疏水性：红色，最疏水；蓝色，最亲水。C类，PTCD1基因位点和蛋白质示意图概述。给出了用于CRISPR/Cas9介导的敲除的gRNA（橙色箭头）和用于基于PCR的敲除鉴定的引物（蓝色箭头）的位置。虚线分隔在淘汰赛中删除的PTCD1部分。显示R113W的位置（红色箭头）。天,E类，HeLa PTCD1 KO克隆1、2和亚形态克隆3的确认低能.天，通过Western blotting检测WT-HeLa细胞和KO克隆KO#1-#3的细胞裂解液中的PTCD1蛋白低能.E类蛋白质水平被量化并归一化为WT。肌动蛋白被用作负荷控制。来自六个独立实验的量化数据，以平均值±SEM表示***第页通过单向方差分析，细胞系之间≤0.001事后（post-hoc）Tukey的多重比较测试。通过PCR和测序确认HeLa PTCD1 KO细胞克隆，见图1-1。
图2。
图2。
PTCD1 KO细胞缺乏氧化磷酸化，依赖糖酵解产生能量。A类,B类，Seahorse分析的代表性痕迹显示WT和KO（PTCD1 KO#1，2）细胞和PTCD1低形态表达细胞（PTCD1KO#3）的细胞OCR和ECAR（糖酵解测定）低能). 箭头表示添加抑制剂以询问指示的呼吸参数。C类,天量化WT和KO细胞的基本呼吸和最大呼吸以及备用呼吸容量（在ATP需求增加时将OCR提高到基线以上的能力）。E类,F类，含和不含PTCD1细胞糖酵解基线和峰值（阻断OXPHOS后）的定量Seahorse数据以及糖酵酵解储备。G公司，PTCD1 KO细胞能量代谢表型总结。图2-1中提供了其他Seahorse分析控制。H（H），在半乳糖或乙酰乙酸代替葡萄糖的培养基中培养的WT和KO细胞中的细胞ATP水平。更换培养基（0 h），并对细胞进行裂解，以测量指定时间点的ATP浓度。来自三个独立实验的所有量化数据均以平均值±SEM表示*第页≤ 0.05, **第页≤ 0.01, ***第页通过单向方差分析，细胞系之间≤0.001(C类——F类)或双向方差分析(H（H）)带有事后（post-hoc）Tukey的多重比较测试。所有OCR和ECAR值均归一化为蛋白质含量。
图3。
图3。
PTCD1缺失时线粒体破碎，嵴超微结构改变。A类，WT和PTCD1 KO细胞裂解物中线粒体标记蛋白的代表性Western blot。B类，线粒体标记蛋白丰度的量化，如所示A类ACTIN用作负荷控制，蛋白水平标准化为WT细胞。C类用mtDNA和nDNA基因组上的靶基因qPCR评估细胞线粒体含量。β-2-微球蛋白被用作nDNA上的靶基因，并将值归一化为WT。天，典型的共焦图像显示PTCD1 KO细胞线粒体碎片（TOM20；绿色）（核染色：DAPI；蓝色）。方形表示下方放大的区域。下图，图像处理后的线粒体和应用粒子掩膜进行分析。比例尺，30μm。E类，共聚焦图像中线粒体形态的半自动粒子分析，如所示天每个实验平均分析60个细胞。F类在WT和PTCD1 KO细胞的典型TEM图像中，线粒体形态和嵴结构发生明显变化。比例尺，1μ米。数据来自五个(B类)和四个(C类,E类)独立实验，以平均值±SEM表示(B类,C类)或盒须图（中值为最小值和最大值；E类). *第页≤ 0.05, **第页≤ 0.01, ***第页通过单向方差分析，细胞系之间≤0.001事后（post-hoc）Tukey的多重比较测试。WT和PTCD1 KO细胞克隆的其他TEM图像如图3-1所示。
图4。
图4。
PTCD1 KO细胞中功能性ETC复合物的缺乏导致氧化磷酸化缺陷，并被PTCD1表达逆转。A类Western blot检测WT和PTCD1 KO细胞裂解物中的PTCD1和电子传递链复合物亚单位。所选亚基在未结合时不稳定，用于估计组装复合物的水平。B类，细胞裂解物中ETC复合物的定量，如所示A类.C类通过稳定表达PTCD1-Flag（以GFP-T2A-嘌呤霉素、RFP为对照）和ETC复合物，恢复KO细胞（PTCD1 KO#1）中PTCD1的表达，并通过Western blotting方法评估两个独立的救援细胞系（KO#1+PTCD1克隆1、克隆2）中ETC复合体的表达A类GFP检测用于确认转基因表达相等。请注意，PTCD1上的Flag标签会略微增加其MW。天——G公司，WT和PTCD1 KO（KO#1+RFP）细胞和KO细胞重新表达PTCD1（KO#1+PTCD1克隆1，克隆2）的Seahorse分析实验总结。天,E类量化基线呼吸、峰值呼吸（ETC非耦合）和备用呼吸（基础呼吸和最大呼吸之间的差异）。F类,G公司基线时的糖酵解通量，并因线粒体ATP生成受阻而上调（糖酵化储备）。四个变量的量化数据(B类)或三个(天——G公司)独立实验，表示为平均值±SEM*第页≤ 0.05, **第页≤ 0.01, ***第页细胞系之间≤0.001(B类)通过单向方差分析事后（post-hoc）Tukey或KO#1+RFP电池(天——G公司)通过单向方差分析事后（post-hoc）Dunnett的多重比较测试。所有OCR和ECAR值均归一化为蛋白质含量。
图5。
图5。
PTCD1 KO细胞中线粒体rRNA减少。A类，线粒体基因组的示意图，其中基因（彩色框）被tRNA（灰色框）穿插。重链和轻链上的基因分别显示在顶部和底部。B类，qPCR分析概述及引物位置示例。内部引物识别前体和加工转录物，跨越连接的引物只报告前体转录物，而不报告加工RNA。C类——E类，通过qPCR定量WT和PTCD1 KO细胞线粒体rRNA转录水平。C类、线粒体总（前体和成熟）rRNA转录水平。天，用连接引物测量的相对前体rRNA转录物丰度。E类，成熟与前体12S和16S rRNA转录物的比率。剩余线粒体转录物的定量，见图5-1。F类——H（H）WT、PTCD1 KO（KO#1+RFP）和救援细胞系（KO#1+PTCD1克隆1，克隆2）的线粒体rRNA转录水平。总计(F类)和前体(G公司)线粒体rRNA转录水平和成熟/前体比率(H（H）)分析如下C类——E类数据来自三个独立实验，并以平均值±SEM表示*第页≤ 0.05, **第页≤ 0.01, ***第页≤0.001与KO细胞系(C类——E类)或与KO#1+RFP单元的比较(F类——H（H）)通过单向方差分析事后（post-hoc）Dunnett的多重比较测试。
图6。
图6。
质谱分析证实了PTCD1缺失时线粒体核糖体亚单位的丢失和线粒体翻译。A类火山图显示WT和PTCD1 KO#1细胞蛋白质组的定量比较。在细胞裂解液中共鉴定出5075个独特蛋白，KO中304个蛋白的丰度与WT细胞中的差异显著。B类PANTHER过度表达分析KO细胞裂解物中缺失或富集的蛋白质。C类——E类，从WT和PTCD1 KO#1细胞分离的线粒体的MS分析。火山图突出了WT和KO细胞之间选定蛋白质（每个由彩色点表示）丰度的变化。C类线粒体转录、复制和基因组维护中关键蛋白质的比较。天，小28S和大39S线粒体核糖体亚基的线粒体核糖体蛋白以及辅助和翻译因子的丰度。E类，WT和KO细胞中ETC核心亚单位的丰度。从三个独立的生物实验中收集的数据。显著性标准：log2 FC>1.5(A类,B类)，log2 FC>2.0(C类——E类);第页< 0.05. 采用费希尔精确和FDR多重测试校正的PANTHER分析。见图6-1；图6-2；和图6-3。
图7。
图7。
WT和R113W PTCD1拯救PTCD1-KO细胞表型。A类PTCD1在KO细胞（PTCD1 KO#1）中的表达通过稳定表达WT或R113W PTCD1-Flag（RFP作为对照）得以恢复。通过Western blot测定两个独立的救援克隆（KO#1+WT克隆1、2和+R113W克隆1和2）的裂解液中PTCD1和ETC亚基的蛋白水平。注意，PTCD1上的Flag标签略微增加了其MW。ACTIN被用作负载控制。PTCD1蛋白水平的定量，见图7-1。B类——F类比较KO#1+PTCD1-WT和+PTCD1R113W细胞系不同KO表型的挽救程度。显示WT HeLa细胞和PTCD1 KO细胞（KO#1+RFP）作为对照。B类，救援细胞系中ETC复合蛋白的定量，如所示A类将值归一化为WT-HeLa细胞中的水平。C类，比较PTCD1 WT或R113W挽救的细胞中12S和16S rRNA成熟/前体转录比率。值归一化为WT-HeLa单元。天用Seahorse分析平台测量的指示细胞系中的OXPHOS活性和糖酵解通量。OCR和ECAR值归一化为蛋白质含量。E类糖酵解储备，即对线粒体ATP生成受阻的反应，糖酵分解在基线水平上的最大上调。F类，在含有葡萄糖或半乳糖的培养基中培养的细胞中的细胞ATP水平。更换培养基（0 h），并对细胞进行裂解，以测量指定时间点的ATP浓度。数据来自四个独立实验，以平均值±SEM表示（RFP样本显示为对照）*第页≤ 0.05, **第页≤ 0.01, ***第页单向救援细胞系之间≤0.001(B类——E类)或双向(F类)方差分析事后（post-hoc）Tukey的多重比较测试。
图8。
图8。
PTCD1活性降低的神经元含有较少处理的线粒体rRNA，ATP水平较低，自发活动减弱。A类,B类，确认原代神经元中RNAi介导的PTCD1下调。将神经细胞培养物与封装在纳米颗粒中的siRNA孵育4和8天。通过Western blotting评估细胞裂解物中PTCD1蛋白和mRNA水平(A类)和qPCR(B类).C类，使用荧光细胞抗敏染料对PTCD1敲除8天后的细胞活力进行基于图像的量化。天用对照和PTCD1 siRNA处理的神经元裂解液中ETC蛋白的代表性Western blot。ACTIN用作负荷对照。E类——G公司，在siRNA处理4和8天后，通过qPCR对神经元线粒体12S和16S rRNA转录物进行定量。E类、线粒体总（前体和成熟）rRNA转录水平。F类，用连接引物测定相对前体rRNA转录物丰度。G公司，成熟与前体12S和16S rRNA转录物的比率。H（H）,我，OXPHOS活性定量(H（H）)和糖酵解通量(我)使用Seahorse分析系统对PTCD1敲除和未敲除的神经元进行检测。分别在ETC解偶联和复合V抑制后测量最大呼吸和糖酵解。J型，未处理的神经元培养物和用指示的siRNA处理8天的培养物的细胞ATP含量。K（K）在对照组和PTCD1敲除培养物中用MEA测量自发神经元活性。显示了电生理参数的量化。量化数据来自三个独立实验，以平均值±SEM表示*第页≤ 0.05, **第页≤ 0.01, ***第页≤0.001与未配对、双尾的各自控制t吨测试(B类,E类——G公司)PTCD1敲除与对照组和无治疗组相比，通过单因素方差分析事后（post-hoc）Tukey多重比较试验(C类,H（H）——K（K）). 图8-1中可用的四维时间点的附加数据和量化。
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中的注释

  • 线粒体和阿尔茨海默病：PTCD1是吸烟枪吗？
    Pa J、Andrews SJ、Swerdlow RH。 Pa J等人。 《神经科学趋势》。2019年11月；42(11):759-762. doi:10.1016/j.tins.2019.08.003。Epub 2019年8月14日。 《神经科学趋势》。2019 PMID：31421943 免费PMC文章。

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