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.2019年4月4日；4（7）：e124174。
doi:10.1172/jci.insight.124174。

Site-1蛋白酶衍生的可溶性（前）肾素受体靶向血管加压素受体2以增强尿浓缩能力

王飞（音译） 1 2, 徐传明 1 2, 罗仁飞 1 2, 彭可欣 1 2, 尼鲁帕马·拉姆库马尔 1, 谢世英（Shiying Xie） 1 2, 小寒路 1 2, 赵龙 1, 左昌江 1, 唐纳德·科汉 1, 杨天欣 1 2 三
附属机构

Site-1蛋白酶衍生的可溶性（前）肾素受体靶向血管加压素受体2以增强尿浓缩能力

王飞（音译）等。 JCI洞察力. .

摘要

抗利尿激素加压素（AVP）通过其在集合管（CD）中的2型受体（V2R）发挥作用，严重控制尿浓缩能力。在这里，我们报道了1号位点蛋白酶衍生（S1P-衍生）可溶性（前）肾素受体（sPRR）通过靶向V2R参与液体稳态的调节。在培养的内髓集合管（IMCD）细胞中，AVP-诱导的V2R表达被PRR拮抗剂PRO20钝化；PRR中和抗体；或S1P抑制剂PF-429242。同时，AVP增加sPRR释放，PF-429242减少sPRR。给予组氨酸标记的sPRR（sPRR-His）刺激V2R表达，并逆转PF-429242对AVP诱导的表达的抑制作用。PF-429242治疗C57/BL6小鼠后，尿浓缩能力受损，sPRR-His对其进行了抢救。在肾小管特异性S1P缺失的小鼠中进行了这一观察。在S1P单独或与sPRR-His联合进行药理或基因操作期间，尿浓度的变化与V2R和水通道蛋白-2（AQP2）的肾表达平行。总之，这些结果支持S1P-衍生的sPRR在决定肾V2R表达以及尿浓缩能力方面发挥关键作用。

关键词：肾脏学；运输。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。

数字

图1
图1。PRR介导的AVP上调V2R在原代大鼠IMCD细胞中的表达。
用PRO20或抗-PRR-N抗体预处理IMCD细胞，然后用10 nM AVP处理24小时。V（V）2R蛋白表达通过免疫印迹法测定，并通过β-肌动蛋白标准化。(A类)抗V抗体的验证2使用V的R抗体2R小核糖核酸(n个=每组3个）。(B类)AVP单独或与PRO20联合应用对V的影响2R表达式(n个=每组6个）。(C类)AVP单独或联合抗-PRR-N抗体对V的影响2R表达式(n个=每组6个）。在另一个实验中，用β-连环蛋白抑制剂ICG001（ICG）预处理原代大鼠IMCD细胞，然后用10 nM sPRR-His处理24小时。V（V）2R蛋白表达通过免疫印迹和qPCR测定，并分别通过β-肌动蛋白和GAPDH标准化。(D类)sPRR-His单独或联合ICG对V的影响2R蛋白表达(n个=每组6个）。(E类)sPRR-His单独或联合ICG对V的影响2R mRNA表达(n个=每组6个）。使用未配对学生的t吨测试。数据为平均值±SEM。CTR，对照*P（P）与对照组相比<0.05；#P（P）与AVP或sPRR-His单独治疗相比，<0.05。
图2
图2。单独或联合sPRR-His抑制S1P对AVP诱导的V2CD细胞中R和AQP2的表达。
用PF单独或与sPRR-His联合预处理原代大鼠IMCD细胞，然后用10nM AVP处理24小时。V的表达式2免疫印迹法分析R和AQP2。用ELISA法测定培养基sPRR浓度，并用蛋白质含量归一化。(A类)V的免疫印迹分析2R和AQP2表达(n个=每组3人）。密度测定值显示在斑点下方。(B类)培养基sPRR含量的ELISA分析(n个=每组6个）。采用单因素方差分析和Bonferroni检验进行多重比较，确定统计显著性*P（P）与对照组（CTR）相比<0.05；#P（P）<0.05与PF-429242单独使用相比，&P（P）与AVP相比<0.05。
图3
图3。C57/BL6小鼠S1P抑制利尿作用的体内特征。
雄性C57/BL6小鼠接受S1P抑制剂PF-429242（PF）的皮下输注，同时输注或不输注sPRR-His 4天。接受溶媒治疗的小鼠作为对照。在实验结束时，进行24小时尿液采集，然后进行尿液sPRR排泄的ELISA分析。(A类)尿sPRR排泄的ELISA分析(n个=每组10只小鼠）。(B类)尿量(n个=每组10只小鼠）。(C类)尿渗透压(n个=每组10只小鼠）。(D类)急性AVP治疗的尿渗透压反应分析(n个=每组10只小鼠）。(E类)血浆AVP浓度的ELISA分析(n个=每组6只小鼠）。(F类)血浆渗透压(n个=每组6只小鼠）。采用单因素方差分析和Bonferroni检验进行多重比较，确定统计显著性*P（P）与对照组相比<0.05；#P（P）与单独PF相比，<0.05。
图4
图4。单独或联合sPRR-His抑制SIP对V肾表达的影响2R、 C57/BL6小鼠的转运蛋白和自噬体标记。
雄性C57/BL6小鼠用载体、PF单独或与sPRR-His联合治疗。V的肾脏表达2R、 用免疫印迹法分析AQP2、NKCC2和自噬体标记物（p62和LC3b）。(A类)V的免疫印迹分析2R和AQP2表达(n个=每组8只小鼠）。(B类)NKCC2、p62和LC3b表达的免疫印迹分析(n个=每组8只小鼠）。密度测定值显示在斑点下方。使用未配对学生的t吨测试*P（P）与对照组（CTR）相比<0.05；#P（P）与单独PF-429242相比，<0.05。
图5
图5。S1P诱导性肾小管特异性缺失的验证。
(A类)分别使用引物P1×P2和P1×P3检测漂浮和重组等位基因的PCR策略示意图。(B类)用P1×P2进行PCR扩增检测S1P各器官中的漂浮等位基因飞行/飞行-Cre公司+和S1P飞行/飞行-克里–多西环素治疗后的小鼠。WT表示C57/BL6鼠标。这种扩增产生了一个434-bp的floxed等位基因产物和一个380-bp的WT等位基因。(C类)用P1×P3进行PCR扩增检测S1P各器官的重组等位基因飞行/飞行-Cre公司+强力霉素治疗后。重组等位基因被检测为1800-bp的产物。(D类)在蛋白质水平确认肾脏S1P缺失。免疫印迹法分析相同强力霉素治疗后具有指定基因型的小鼠肾脏S1P蛋白表达。
图6
图6。RT S1P–KO小鼠液体稳态分析和sPRR-His表型拯救。
在3至4个月龄时，RT S1P–KO小鼠通过渗透微型泵以30μg/kg/天的速度输注溶媒或sPRR-His，持续7天。实验结束时，进行24小时尿液采集，并测定急性AVP注射后的尿液渗透压反应。(A类)尿量(n个=每组8只小鼠）。(B类)尿渗透压(n个=每组8只小鼠）。(C类)尿液渗透压反应的变化和急性AVP治疗的比率。通过膀胱按摩排空尿液，并在AVP（720 ng/kg体重）治疗前后测量渗透压(n个=每组8–9只小鼠）。采用单因素方差分析和Bonferroni检验进行多重比较，确定统计显著性。数据为平均值±SEM*P（P）与对照组相比<0.05；#P（P）<0.05，仅与RT S1P–KO小鼠相比。
图7
图7。V的肾脏表达分析2sPRR-His输注后RT S1P–KO小鼠的R和转运蛋白。
V的肾脏表达2R、 通过免疫印迹分析分析NKCC2和AQP2。左侧面板显示了基因型之间的基线值。右侧面板显示sPRR-His输注后空白小鼠的变化。密度测定值用β-肌动蛋白标准化，并显示在斑点下方。值得注意的是，为了更好地比较两组，RT S1P–KO组的蛋白质样本来自相同的动物。通过使用未配对学生的t吨测试*P（P）与floxed相比<0.05；#P（P）与RT S1P–KO小鼠相比，<0.05。
图8
图8。肾V分析2PRR-KO小鼠的R表达。
在基础条件下，采集CD-PRR-KO和RT-PRR-KO小鼠的肾脏及其相应的漂浮对照，并分析V2R表达式。(A类和C类)肾V的免疫印迹分析2R表达式。(B类和D类)病毒的qPCR分析2R mRNA表达(n个=每组5只小鼠）。使用未配对学生的t吨测试。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与floxed。
图9
图9。sPRR-His输注对PRR-KO小鼠尿浓缩能力的影响。
CD-PRR-KO和RT-PRR-KO小鼠分别以30μg/kg/天的剂量进行sPRR-His输注，持续4天和7天。实验结束时，进行24小时尿液采集。(A类和B类)ELISA法测定尿sPRR排泄(n个=每组5-8只小鼠）。(C类)CD-PRR-KO小鼠的尿量(n个=每组5只小鼠）。(D类)CD-PRR-KO小鼠的尿液渗透压(n个=每组5只小鼠）。(E类)RT PRR–KO小鼠的尿量(n个=每组6只小鼠）。(F类)RT PRR–KO小鼠的尿液渗透压(n个=每组6只小鼠）。通过使用单向方差分析和Bonferroni检验进行多重比较来确定统计显著性。数据为平均值±SEM*P（P）与对照组相比<0.05；#P（P）与PRR KO小鼠相比，<0.05。
图10
图10。V的肾脏表达分析2sPRR-His输注后PRR-KO小鼠的R和转运蛋白。
(A类)V在肾脏表达的免疫印迹分析2CD-PRR-KO（左面板）和RT-PRR-KO小鼠（右面板）中的R和AQP2，分别注射和不注射sPRR-His。(B类)在基础条件下对漂浮和RT PRR–KO小鼠肾脏NKCC2表达和自噬体积累标记物（包括p62和LC3b）进行免疫印迹分析（左侧面板）。在RT PRR–KO/vehicle和RT PRR-KO/sPRR-His小鼠（右侧面板）之间对这些蛋白质的丰度进行了比较。用β-肌动蛋白对数值进行标准化，并显示在斑点下方。使用未配对学生的t吨测试*P（P）与floxed相比<0.05；#P（P）与PRR-KO小鼠相比<0.05。
图11
图11。sPRR-His输注对PRR-KO小鼠急性精氨酸加压素（AVP）治疗后尿液渗透压反应的影响。
通过膀胱按摩排空尿液，并在AVP治疗前后测量渗透压（720 ng/kg体重）。(A类和B类)所示为CD-PRR-KO小鼠尿液渗透压变化的比率(n个=每组6只小鼠）(A类)和RT PRR–KO小鼠(n个=每组6-7只小鼠）(B类). (C类)floxed、CD-PRR-KO/vehicle和CD-PRR-KO/sPRR-His小鼠20小时尿AVP排泄(n个=每组6-8只小鼠）。(D类)floxed、RT PRR–KO/vehicle和RT PRR-KO/sPRR-His小鼠20小时尿AVP排泄(n个=每组6只小鼠）。采用单因素方差分析和Bonferroni检验进行多重比较，确定统计显著性。数据为平均值±SEM*P（P）与对照组相比<0.05；#P（P）<0.05，仅与PRR-KO小鼠相比。
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