Non-Thermal Plasma as a Unique Delivery System of Short-Lived Reactive Oxygen and Nitrogen Species for Immunogenic Cell Death in Melanoma Cells

doi:10.1002/advs.201802062

.2019年1月28日；6(6):1802062.

doi:10.1002/advs.201802062。 eCollection 2019年3月20日。

非热等离子体作为黑色素瘤细胞免疫原性细胞死亡的短寿命活性氧和氮的独特输送系统

附属公司

¹等离子体、激光烧蚀和表面建模——安特卫普大学（PLASMANT）比利时安特卫蓬威利克分校，邮编：12610。
²比利时安特卫普大学肿瘤研究中心（CORE），邮编：12610。
^三比利时安特卫普大学生物医学系，邮编：12610。
⁴生物分子和分析质谱（BAMS）小组安特卫普大学化学系和蛋白质组学中心Groenenborgerlaan 171 2020 Antwerpen Belgium。
⁵比利时安特卫普大学药学系，邮编：12610。

PMID： 30937272
预防性维修识别码： PMC6425452型
内政部： 10.1002/advs.201802062

非热等离子体作为黑色素瘤细胞免疫原性细胞死亡的短寿命活性氧和氮的独特输送系统

亚伯拉罕·林等。高级科学（Weinh）. 2019.

.2019年1月28日；6(6):1802062.

doi:10.1002/advs.201802062。 eCollection 2019年3月20日。

附属公司

¹等离子体、激光烧蚀和表面建模——安特卫普大学（PLASMANT）比利时安特卫蓬威利克分校，邮编：12610。
²比利时安特卫普大学肿瘤研究中心（CORE），邮编：12610。
^三比利时安特卫普大学生物医学系，邮编：12610。
⁴生物分子和分析质谱（BAMS）小组安特卫普大学化学系和蛋白质组学中心Groenenborgerlaan 171 2020 Antwerpen Belgium。
⁵比利时安特卫普大学药学系，邮编：12610。

PMID： 30937272
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内政部： 10.1002/advs.201802062

摘要

癌症免疫治疗的突破性进展已证明取得了相当大的成功，尽管并非没有局限性。用于癌症治疗的非热血浆（NTP）通过诱导免疫原性细胞死亡（ICD）而成为一种潜在的辅助治疗方法。接受ICD的癌细胞刺激患者的免疫系统产生抗癌反应。尽管前景看好，但必须仔细研究NTP诱导的ICD的潜在机制。本文研究了非热等离子体与癌细胞之间的相互作用。血浆产生的短命活性氧和氮物种（例如羟基自由基、原子氧、一氧化氮）是诱发黑色素瘤ICD的主要效应物，而令人惊讶的是，持久性物种却没有。这是使用介质阻挡放电等离子体系统在体外证明的，并在体内接种试验中得到验证。反应性物种的等离子体生成似乎取决于总能量。总之，这项工作为等离子体与生物材料的相互作用提供了基本的见解。此外，它为临床翻译NTP系统的未来开发奠定了基础。将血浆系统添加到现有癌症治疗武库中，为更安全、更稳健地控制癌症的新组合策略提供了可能性。

关键词：癌症；肿瘤免疫治疗；免疫原性细胞死亡；黑色素瘤；非热等离子体；活性氧物种。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
了解非热等离子体如何与癌症靶点相互作用，将有助于战略性开发一种生物医学设备，用于控制RONS的传递，以诱导免疫原性细胞死亡。这可能有助于患者癌症免疫周期的初始步骤，并导致强大的抗癌免疫反应。

图2
使用由微秒脉冲电源提供17 kV电压的DBD电极进行治疗。A）细胞在24孔板中处理。治疗前使用PBS清洗细胞，并在接触血浆前立即从微孔中抽吸。以下示意图（B–D）是放大区域的表示，当*z（z）*定位器用于将DBD电极固定在细胞上方1 mm处进行治疗。B）在该间隙中直接在细胞上产生血浆，细胞被一薄层残余PBS（≤2µL）覆盖。C）对于PEF处理，DBD电极浸没在液体中，添加或不添加RONS，放置在电池上方1 mm处，并像以前一样操作。在这种情况下，虽然细胞仍经历微秒脉冲，但由于液体的高介电强度，没有产生等离子体。D）对于等离子体处理后的液体分析，使用DBD电极处理24孔板中50µL PBS，距离液体表面1 mm。

图3
DBD血浆可导致细胞死亡和CRT暴露，且随着血浆治疗频率的增加而增加。MTX（2微克毫升⁻¹)作为阳性对照。黑色素瘤细胞经血浆处理24小时后，收集细胞并用台盼蓝排斥试验和免疫组化表面暴露CRT分析A）细胞存活率。B）用流式细胞术定量CRT+和PI−细胞的百分比。CRT+/PI−细胞的直方图显示荧光峰值向右移动。此处显示了C）B16F10和D）A375细胞的代表性直方图。这里的数据表示为三到四个独立实验的平均值（SEM）的平均值±标准误差，至少有两个重复。比较所有治疗条件与未治疗条件的统计显著性**P（P）*< 0.05; ***P（P）*< 0.01; ****P（P）*<0.001（广义线性混合模型）。

图4
以细胞处理参数操作的DBD血浆在液体中产生短暂且持久的RONS。立即收集经DBD血浆处理的PBS（50µL）进行分析。用EPR光谱分析了短寿命物种。A） O时₂ ^•−DEPMPO自旋陷阱未检测到，^•OH形成自旋加合物DEPMPO–OH，在固定的处理时间内，随着等离子体处理频率的增加，DEPMPO-OH逐渐减少。B）当血浆治疗频率固定且治疗时间改变时，DEMPO–OH最初增加，随后减少，表明DEMPO-OH正在衰减。C）探针（PTIO）和产物（PTI）均从相同的EPR光谱中同时监测，以测量^•否。PTI和PTIO的超精细值为一 _N1型=一 _氮气=0.80 mT和一 _N1型=0.96 mT和一 _氮气分别=0.44 mT。D）（MGD）的形成₂铁²⁺–MGD中的NO–铁（II）复合物也用于检测^•编号E）O/¹O（运行）₂/O（运行）_三使用TEMP自旋脱扣器检测到叠氮化钠（NaN_三)，一个¹O（运行）₂食腐动物。持续RONS F）ONOO⁻，G）高₂O（运行）₂和H）否₂ ⁻和否_三 ⁻随着等离子体处理强度的增加，几乎呈线性增加。所有测试固定处理时间的实验都是用三到五个重复进行的。这里给出的数据是平均值±标准偏差；存在误差条，但当误差条相对于最大图形平均值（<5%）较小时，误差条不可见。

图5
PEF处理结合RONS溶液诱导细胞死亡，但未诱导表面CRT。持久性RONS溶液由商用来源制备，浓度由500 Hz DBD血浆处理测定。在A）B16F10或B）A375黑色素瘤细胞中，RONS溶液和PEF单独不会引起细胞死亡，类似于在500 Hz下直接DBD血浆治疗的细胞死亡。在C）B16F10或D）A375黑色素瘤细胞中，存在RONS（PEF+RONS）的PEF治疗降低了细胞存活率，但没有增加与ICD、表面CRT相关的DAMP信号，达到与500 Hz DBD血浆治疗相同的水平。在所有图表中，未经处理的对照组的平均值处都有一条虚线。这里表示的数据是三到四个独立实验的平均值±SEM。每组的观察总数显示在每列的底部。将所有治疗条件的统计意义与血浆（500 Hz）进行比较。纳秒，*P（P）*> 0.05; ****P（P）*<0.001（广义线性混合模型）。

图6
DBD血浆的免疫原性潜力并不是由脉冲电场和RONS单独引起的，正如使用疫苗接种试验评估的那样。A）同基因C57BL/6J小鼠接种一次疫苗，并用10⁴下周B16F10黑色素瘤细胞存活(n个=每组8个）。监测B）接种部位和C）激发部位的肿瘤体积。在第7天的图表中放置一条虚线，表示活肿瘤挑战的日期，而在第50天放置一条虚线，表示评估生存率时预定的研究结束。当最后一只患有肿瘤的小鼠达到人类终点时，所有剩余的小鼠一起被处死。D）绘制了整个预定研究持续时间（50 D）的小鼠存活率曲线，并将曲线与对数秩（Mantel–Cox）检验进行了比较。E）这里列出了小鼠两侧的肿瘤发育情况和对抗挑战性肿瘤的保护率。

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