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.2019年4月；17(4):3108-3116.
doi:10.3892/etm.2019.77323。 Epub 2019年2月27日。

miR-29a/b簇通过靶向Notch2抑制高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞内皮-间充质转化

张嘉玉 1, 岳曾 1, 陈嘉伟 1, 蔡大秋 1, 陈成伟 1, 张四方 1, 陈振国 1
附属公司

miR-29a/b簇通过靶向Notch2抑制高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞内皮-间充质转化

张嘉玉等。 实验治疗学. 2019年4月.

摘要

此前有几项研究报道，内皮细胞通过内皮-间充质转化（EndMT）导致增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）的病理性纤维化；然而，这种相互作用的确切机制尚未完全阐明。本研究研究了microRNA（miR）-29a/b簇在人视网膜微血管内皮细胞（HRMEC）中的表达，并检测了其在高糖诱导的EndMT中的功能作用。HRMEC暴露于浓度为5、15、30和50 mM的葡萄糖中7天，并进行逆转录定量聚合酶链反应、western印迹和免疫荧光检测miR-29a/b和EndMT相关基因的表达。此外，还进行了荧光素酶报告基因分析，以确认miR-29a/b与神经原位点notch同源蛋白2（Notch2）之间的关联。miR-29a/b、内皮标志物血管内皮钙粘蛋白和分化簇31的表达水平下降，而Notch2和间充质标志物的表达水平，包括α-平滑肌肌动蛋白、成纤维细胞特异性蛋白1（也称为S100钙结合蛋白A4、S100A4）、，HG（30 nM）条件下，HRMEC中的纤维连接蛋白和SNAI1增加。此外，Notch2被确定为miR-29a和miR-29b的靶点。miR-29a/b的过度表达下调了Notch2的表达，随后抑制了HG诱导的EndMT。综上所述，本研究结果表明miR-29/Notch2信号通路可能参与HG诱导的EndMT的调控，并可能在PDR纤维化过程中作为潜在的分子靶点。

关键词：糖尿病性视网膜病变；内皮-间充质转化；microRNA 29a/b；神经源性位点notch同源蛋白2。

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数字

图1。
图1。
HG刺激HMRECs中miR-29a/b的表达模式。（A） 用RT-qPCR检测用5、15、30和50 mM D-葡萄糖预处理7天的HRMEC中miR-29a/b的mRNA表达。（B） 用RT-qPCR检测用NG（5mM）、HG（30mM）和OSM（5mM葡萄糖+25mM甘露醇）预处理7天的HRMEC中miR-29a/B的mRNA表达。（C） RT-qPCR用于测定用HG或OSM预处理1、3、5或7天的HRMEC中miR-29a/b的mRNA表达。数据以3个不同实验的平均值±标准偏差表示，每个实验均一式三份。数据分析采用单因素方差分析，然后进行Dunnett事后检验*与未治疗组相比，P<0.05。HG，高糖；NG，正常葡萄糖；RT-qPCR、逆转录定量聚合酶链反应；miR，microRNA；OSM，渗透控制；HRMECs，人视网膜微血管内皮细胞。
图2。
图2。
miR-29a/b过度表达抑制HG诱导的HRMEC内皮-间充质转化。用miR-NC、miR-29a模拟物或miR-29b转染HRMEC。（A） RT-qPCR检测miR-29a和miR-29b的表达。数据采用Student t检验进行分析。与模拟NC组相比P<0.05。（B） 在NG（5 mM）和HG（30 mM）条件下持续7天（黑色比例尺，100µm；白色比例尺，50µm），HRMEC中CD31和α-SMA的形态学改变和表达。（C） 采用RT-qPCR检测不同条件下HRMEC中VE-cad、FSP1、FN和蜗牛mRNA的表达。采用单向方差分析和Bonferroni事后检验对数据进行分析，并将数据表示为3个不同实验的平均值±标准偏差，每个实验均一式三份*与NG组相比P<0.05；#与HG组相比P<0.05。HG，高糖；NG，正常葡萄糖；FSP1，成纤维细胞特异性蛋白1；人视网膜微血管内皮细胞；miR，microRNA；NC，非目标控制；血管内皮钙粘蛋白；纤维连接蛋白；RT-qPCR、逆转录定量聚合酶链反应；α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；CD31，分化簇31。
图3。
图3。
Notch2是HRMECs中miR-29a/b的靶基因。通过（A）RT-qPCR和（B）Western blotting检测HG（30mM）刺激7天的HRMEC中Jagged 1、Notch1和Notch2的表达水平。数据采用Student t检验进行分析。（C） 在线TargetScan算法预测miR-29a和miR-29b都与Notch2的3′-UTR结合。（D） 进行萤光素酶报告基因测定以检测Notch2的3′-UTR的相对萤光素酶报告基因活性。数据分析采用单因素方差分析，然后进行Dunnett事后检验*与模拟NC组相比P<0.01。（E） RT-qPCR和western blot分析检测转染模拟/抑制剂NC、miR-29a模拟/抑制剂和miR-29b模拟/抑制剂的HRMEC中Notch2的表达水平。数据通过单向方差分析和Dunnett的事后检验进行分析，并以3个不同实验的平均值±标准偏差表示，每个实验均一式三份*与HG组相比P<0.01。Notch2，神经源性位点notch同源蛋白2；HG，高糖；人视网膜微血管内皮细胞；RT-qPCR、逆转录定量聚合酶链反应；UTR，非翻译区；miR/miRNA，microRNA；NC，非目标控制；WT，野生型；MUT，突变对照。
图4。
图4。
Notch2过度表达可缓解miR-29a/b对内皮-间质转化的抑制作用。（A） pcDNA-Notch2质粒在HRMECs中的转染效率。转染48小时后，在荧光显微镜下分析细胞（比例尺，100µm）。（B） CD31和α-SMA的形态改变和表达（黑色标尺，100µm；白色标尺，50µm）。（C） RT-qPCR和western blot分析检测转染空白pcDNA-载体和pcDNA-Notch2质粒的HRMEC中Notch2的表达。模型组只加入转染试剂。采用单因素方差分析和Dunnett事后检验对数据进行分析*与模拟组相比，P<0.05。（D） 与miR-29a或miR-29b模拟物和pcDNA-载体或pcDNA-Notch2质粒联合转染的HRMEC中VE-cad、FSP1、FN和蜗牛的mRNA表达。数据通过单向方差分析和Bonferroni事后检验进行分析。细胞在NG（5 mM）或HG（30 mM）条件下培养7天。（E） 用RT-qPCR检测转染或不转染SB431542处理的HRMEC中VE-cad、FSP1、FN和蜗牛的mRNA表达。细胞在NG（5 mM）或HG（30 mM）条件下培养7天。数据通过单向方差分析和Bonferroni事后检验进行分析，并以3个不同实验的平均值±标准偏差表示，每个实验一式三份*P<0.05。Notch2，神经源性位点notch同源蛋白2；HG，高糖；NG，正常葡萄糖；FSP1，成纤维细胞特异性蛋白1；人视网膜微血管内皮细胞；增强型绿色荧光蛋白EGFP；α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；CD31，分化簇31；纤维连接蛋白；血管内皮钙粘蛋白；miR，microRNA；转化生长因子β1抑制剂SB431542。
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