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.2019年4月1日;17(4):e2007044。
doi:10.1371/journal.pbio.2007044。 eCollection 2019年4月。

利用扩展的自噬报告试剂盒进行CRISPR筛查,发现TMEM41B是一种新型自噬因子

附属公司

利用扩展的自噬报告试剂盒进行CRISPR筛查,发现TMEM41B是一种新型自噬因子

克里斯托弗·肖梅克等。 公共科学图书馆生物. .

摘要

酵母正向遗传学的力量是自噬研究领域的坚实基础。对高等真核生物自噬的补充研究揭示了这一过程的深层保存,以及在发育、免疫和神经元稳态的背景下调控自噬过程的新机制。最近出现了基于新簇状规则间隔回文重复序列/CRISPR-associated protein 9(CRISPR/Cas9)的技术,该技术开始通过哺乳动物细胞的正向遗传筛选,帮助定义新的自噬因子和途径。在这里,我们着手开发一个适用于CRISPR/Cas9筛查的自噬报告员扩展工具包。我们在哺乳动物细胞中对报告者进行的全基因组筛查几乎恢复了所有已知的自噬相关(ATG)因子以及以前未标记的因子,包括空泡蛋白分选37同源物A(VPS37A)、跨膜蛋白251(TMEM251)、肌萎缩侧索硬化2(ALS2)和TMEM41B。为了验证这个数据集,我们使用定量显微镜和生化分析显示吞噬细胞成熟需要1个新的hit,TMEM41B。TMEM41B是一种完整的内质网(ER)膜蛋白,与已建立的自噬因子空泡膜蛋白1(VMP1)有着远亲关系,我们的数据表明,这两个因子在自噬体生物发生中发挥着相关但不完全重叠的作用。总之,我们的工作揭示了新的ATG因子,揭示了自噬受体遗传相互作用的可塑性网络,并提供了宝贵的资源(http://crispr.deniclab.com)用于进一步挖掘新的自噬机制。

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数字

图1
图1。一个扩展的自噬报告器工具包的性能与tfLC3相当。
(A) tf受体如何测量自噬流量的示意图。tf受体与靶细胞结合,并与自噬机制的其他成分如脂溶性LC3(黑色卵形细胞)结合。GFP荧光在低pH环境中选择性猝灭,导致tf受体暴露于溶酶体腔后红绿比增加。虚线表示溶酶体水解酶降解。(B) 表达AAVS1位点所示tf蛋白的K562细胞在基础条件下和用100 nM BafA1或250 nM torin处理18 h后通过流式细胞术进行分析。每个报告者的值均按BafA1处理标准化。图中显示了红绿比例的中位数、内部四分位数(方框区域)以及第10和第90百分位数(胡须)。n个>每个样本1000个细胞。与S1图相关的所有汇总统计的基础数据可在S1数据中找到。AAVS1,腺相关病毒整合位点1;BafA1、Bafilomycin A1;绿色荧光蛋白;LC3,微管相关蛋白1轻链3B;NBR1,BRCA1基因1的邻居;NDP52,核点蛋白52;SQSTM1,固位体1;TAX1BP1,tax1结合蛋白1;tf,串联荧光。
图2
图2。使用tfReporters的全基因组CRISPR筛查揭示了已知的和新的基础自噬调节器。
(A) 示意图描述了一种用于在基础条件下定义tfReporters(tfLC3和tfReceptors)遗传修饰物的混合CRISPR筛选策略。用布鲁内洛慢病毒sgRNA文库转导表达Cas9的K562细胞。根据红绿比收集细胞顶部和底部的三分之一。通过Illumina测序获得收集细胞的sgRNA序列,并通过MAGeCK进行分析。(B) 所示为所示sgRNAs的平均β得分热图(类似于折叠富集)。分数根据所示sgRNA的作用进行颜色编码(红色,sgRNA抑制自噬;蓝色,sgRNA增强自噬)。为了进行比较,已知的ATG因子(无论效果大小)与新的点击数一起呈现。基因根据其已知功能松散地聚集在一起。在“其他”项下列出的sgRNAs(例如TMEM41B)是从贝塔得分排名前50位的目标中选出的,大约有一名或多名记者点击了这些sgRNAs。在“增强子sgRNAs”中列出的sgRNAs靶向6个基因,这些基因的得分高于已知的最核心的自噬调节因子MLST8。S2数据和S3数据分别显示了基本读取计数和贝塔得分。数据的交互式界面也可在线访问http://crispr.deniclab.com.ATG,自噬相关;Cas9,CRISPR相关蛋白9;CRISPR,簇状规则间隔回文重复;荧光活化细胞分选;LC3,微管相关蛋白1轻链3B;MAGeCK,全基因组CRISPR-Cas9基因敲除的基于模型的分析;MLST8,MTOR相关蛋白LST8同源物;sgRNA,单导向RNA;tf,串联荧光;TMEM41B,跨膜蛋白41B;VMP1,液泡膜蛋白1。
图3
图3。在单基因敲除实验中,新的屏幕点击可以产生自噬表型。
(A) 联合表达Cas9和tfSQSTM1的K562细胞用针对指定基因的单个sgRNA或非靶向sgRNA对照物进行转导。用都灵预处理细胞以最大化tfSQSTM1信号的动态范围,并用流式细胞术进行分析(n个>5000个电池)。图中显示了R中使用ggplot2生成的小提琴图。每个样本的中值由黑线标识。使用FlowJo的BifurGate函数以无偏见的方式解卷双峰种群。所有样本上的黑色虚线对应于未受影响细胞的红绿比(即负ctl 1)。所有样品上的红色虚线对应于在最大抑制条件下观察到的比率(sgATG9A)。有关剩余tfReporter的类似数据,请参见S2A–S2D图。(B) 根据A部分和S2A–S2D图中的主要数据得出的显示基因敲除的表型强度的热图。每个群体的红绿比例中值用于根据以下公式计算折叠抑制:(比率sgGene基因−比率sgATG9A型)÷(比率sg控制−比率sgATG9A型)假设sgATG9A产生真正的自噬-空表型。深浅的红色表示较强的抑制表型。黑框表示未评分案例。与S2图相关的所有汇总统计的基础数据可在S1数据中找到。酸性磷酸酶1;ATG,自噬相关;Cas9,CRISPR相关蛋白9;ctl,对照;EPG5,异位P颗粒自噬蛋白5同源物;LOH12CR1,杂合性缺失12染色体区域1;MEF2BNB,MEF2B邻居;RB1CC1、RB1感应线圈1;sgRNA,单导向RNA;SQSTM1,固位体1;tf,串联荧光;TMEM251,跨膜蛋白251;TMEM41B,跨膜蛋白41B;VPS37A,液泡蛋白分选37同源物A;WIPI2,WD重复结构域,磷脂酰肌醇相互作用2。
图4
图4。自噬通量需要TMEM41B。
(A) 提取自WT和TMEM41B公司击倒对手HEK293T细胞通过SDS-PAGE和带有指示抗体的IB进行分离。在装载之前,使用BCA分析通过总蛋白对所有样品进行标准化。I和II表示LC3的未修饰和脂质化形式。条形图显示了3个独立实验中每个样本的平均值±SD。WT细胞的蛋白质水平标准化为1;第页-使用一个样本确定值t吨测试*第页< 0.05. (B) WT和tmem41磅击倒对手用250 nM BafA1处理HEK293T敲除细胞达到指定时间。相应的细胞提取物用总蛋白归一化,用SDS-PAGE进行解析,并用IB分析LC3。I和II表示LC3的未修饰和修饰形式。条形图显示了3个独立实验中每个样本的平均值±SD;第页-使用一个样本确定值t吨测试*第页< 0.05. 与S3图相关的所有汇总统计的基础数据可以在S1数据中找到。BafA1、Bafilomycin A1;BCA,双钦酸;HEK,人胚胎肾;免疫印迹法;LC3,微管相关蛋白1轻链3B;NDP52,核点蛋白52;ns,不显著;SQSTM1,固位体1;TAX1BP1,tax1结合蛋白1;TMEM41B,跨膜蛋白41B;WT,野生型。
图5
图5。吞噬细胞成熟需要TMEM41B。
(A) 检测封闭自噬体的蛋白酶保护试验示意图。当被适当密封的囊泡隔离时,胰蛋白酶可以保护靶标免受蛋白水解。(B) 在温和的机械裂解之前,用100 nM BafA1处理WT和指示的HEK293T敲除物18小时。相应的细胞提取物在通过SDS-PAGE溶解之前按照指示进行处理,并通过IB用指示的抗体进行分析。NDP52是一个典型的自噬靶点;微管蛋白是非结合的,是蛋白质水解的控制因素。条形图显示了3个独立实验中每个样本的平均值±SD;第页-值是由一名学生确定的t吨测试*第页< 0.01. 与S4图相关。所有汇总统计的基础数据可在S1数据中找到。BafA1、Bafilomycin A1;HEK,人胚胎肾;免疫印迹法;NDP52,核点蛋白52;ns,不显著;TMEM41B,跨膜蛋白41B;WT,野生型。
图6
图6。TMEM41B公司击倒对手细胞在自噬体生物发生中积累未解决的中间产物。
(A) 在共焦显微镜分析之前,用250 nM托林处理野生型和指示的HEK293T敲除细胞指定的时间。所示为典型共焦显微照片(作为最大强度投影)。显微照片的选定区域(白框)显示为IF针对指示蛋白质的单个和合并通道的插图。LC3,洋红;WIPI2,绿色;合并,白色;赫斯特,蓝色。比例尺:大面板,5μm;小面板,1μm。(B) 图中显示了野生型和HEK293T基因敲除细胞中指示点状突起的平均值,在A部分中显示了内四分位数(方框区域)、1.5个四分位数范围(胡须)和离群值(点)。样本大小(n个)对于每个样品,都有指示。(C) 通过共焦显微镜分析HEK293T细胞的野生型和指示单细胞和双细胞的典型共焦显微照片(作为最大强度投影)。显微照片的选定区域(白框)显示为IF针对指示蛋白质的单个和合并通道的插图。LC3,洋红;WIPI2,绿色;合并,白色;赫斯特,蓝色。比例尺:大面板,5μm;小面板,1μm。(D) 图中显示了在C部分成像的细胞中指示点状突起的平均值,并显示了内四分位数(方框区域)、1.5个四分位数范围(胡须)和离群值(点)。样本大小(n个)对于每个样品,都有指示。与S5图相关的所有汇总统计的基础数据可在S1数据中找到。ATG,自噬相关;DKO,双淘汰赛;HEK,人胚胎肾;IF,免疫荧光;LC3,微管相关蛋白1轻链3B;RB1CC1、RB1感应线圈1;TMEM41B,跨膜蛋白41B;WIPI2,WD重复结构域,磷酰肌醇相互作用2。
图7
图7。自噬体前膜无法结合TMEM41B公司击倒对手细胞。
HEK293T的CLEMTMEM41B公司击倒对手(A和B)和表达tfLC3的野生型HEK293T细胞(C)在基础条件下生长(无药物治疗)。分析工作流由绿色箭头指示。白色箭头表示感兴趣的典型结构。在随后的图像中,白色方框标出缩放区域。蓝色表示Hoechst 33342。A组包括用于对GFP阳性区域的膜结构进行三维重建(在B中)的样本断层摄影。绿色表示膜板和管;青色表示膜泡。有关CLEM分析的详细信息,请参阅材料和方法。与S6图相关的CLEM、相关光学和电子显微镜;绿色荧光蛋白;HEK,人胚胎肾;LC3,微管相关蛋白1轻链3B;透射电镜;tf,串联荧光。
图8
图8。TMEM41B与VMP1共享结构同源性和功能冗余。
(A) 囊泡分馏方案示意图。(B) WT和指示的HEK293T敲除细胞按A组所述进行分馏。分馏部分用SDS-PAGE进行分离,然后用指示抗体进行IB。将膜组分作为15X浓缩液装载。(C) tfEmpty、tfVMP1或tfTMEM41B表达结构整合在WT和HEK293T敲除细胞的AAVS1位点。在用SDS-PAGE和IB与所示抗体进行分离之前,用总蛋白对细胞裂解液进行标准化。每个车道下显示了相对于WT(tfEmpty)细胞的LC3-II水平(归一化为微管蛋白)。(D) C中显示的LC3-II水平的定量。将每个泳道中的LC3-II水平标准化为微管蛋白。WT(空)细胞中的LC3-II水平设置为1。条形图显示了3个独立实验中每个样本的平均值±SD;第页-值是由一名学生确定的t吨测试*第页< 0.02. (E) 在温和的机械裂解之前,用100nM BafA1处理来自C的HEK293T细胞18小时。相应的细胞提取物在通过SDS-PAGE溶解之前按照指示进行处理,并通过IB用指示的抗体进行分析。NDP52是一个典型的自噬靶点;微管蛋白是非结合的,是蛋白质水解的控制因素。条形图显示了3个独立实验中每个样本的平均值±SD;第页-值是由一名学生确定的t吨测试*第页< 0.02. 与S7图相关的所有汇总统计的基础数据可在S1数据中找到。AAVS1,腺相关病毒整合位点1;ATG,自噬相关;BafA1、Bafilomycin A1;绿色荧光蛋白;HEK,人胚胎肾;免疫印迹法;LC3,微管相关蛋白1轻链3B;NDP52,核点蛋白52;ns,不显著;RB1CC1、RB1感应线圈1;SQSTM1,固位体1;Sup,上清液;TAX1BP1,tax1结合蛋白1;tf,串联荧光;TMEM41B、跨膜蛋白41B;VMP1,液泡膜蛋白1;WIPI2,;WT,野生型。

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引用人

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