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.2019年6月；10(3):662-686.
doi:10.1002/jcsm.12404。 Epub 2019年3月27日。

通过肌抑制素/激活素信号的衰减压缩进展期小鼠模型的发病率

哈立德·阿利奥达维 1 2, 威尔伯特·P·弗梅伊 三 4, 萨利赫·奥马利 1 2, 奥利弗·克雷茨 5 6 7, 马克·霍普金森 8, 弗朗西丝卡·索拉尼亚 6, 芭芭拉·乔奇 7, 雷娜塔·M·C·勃兰特 三, 桑德·巴恩霍恩 三, 尼科尔·范·弗利特 三, Yanto Ridwan公司 三 9, 杰伦·埃塞斯 三 10 11, 罗伯特·米切尔 1, 塔林·莫拉什 1, 阿尔贾·帕斯捷尔纳克 12, 奥利·里特沃斯 12 13, 安东尼奥斯·马萨卡斯 14, 亨利·科林斯-胡珀 1, 托拜厄斯·胡贝尔 5 6 15 16, Jan H J Hoeijmakers公司 三 4 17, 凯坦·帕特尔 1 16
附属机构

通过肌抑制素/激活素信号的衰减压缩进展期小鼠模型的发病率

哈立德·阿利奥达维等。 J肌肉恶病质. 2019年6月.

摘要

背景：支持我们理解衰老的一个原则是，DNA损伤会引发应激反应，从而将细胞资源从生长转向维持。一个对比鲜明且似乎不可调和的观点是，促进骨骼肌的生长会给系统带来益处。

方法：为了研究这些公理的稳健性，我们通过使用抑制肌抑制素/激活素信号的激活素受体IIB配体陷阱，在小鼠前体模型中诱导肌肉生长。然后对进展期小鼠的神经和肌肉功能以及肌肉、肾脏、肝脏和骨骼的细胞特征进行研究。

结果：我们展示了Ercc1的肌肉Δ/-进展期小鼠经历了严重的消瘦（与正常体重相比，后肢肌肉质量减少了40-60%），这在很大程度上通过使用可溶性激活素受体IIB（sActRIIB）减弱肌抑制素/激活素信号而得到保护（与未经治疗的进展期相比增加了30-62%）。sActRIIB治疗的进展型小鼠保持了肌肉活动（每小时行程：未治疗小鼠5.6米，治疗小鼠13.7米），并增加了比力（未治疗小鼠19.3 mN/mg，治疗小鼠24.0 mN/mg）。sActRIb治疗前体小鼠也能改善卫星细胞的功能，尤其是其在天然基质上增殖的能力（未经处理的前体小鼠每纤维2.5个细胞，而sActRib处理的后体小鼠在培养72小时后每纤维5.4个细胞）。除了对肌肉的直接保护作用外，我们还发现其他器官的系统性改善，包括肾脏的结构和功能；尿液中的蛋白质含量大幅度下降（经sActRIIB治疗的4.9例白蛋白/肌酐与未经治疗的15.7例相比），这可能是足细胞足突正常化的结果，足细胞足突起构成了滤过装置（经sACTRIB治疗后，肾小球基底膜厚度从224纳米降至177纳米）。用激活素配体陷阱治疗进展期小鼠，可防止肝脏异常的发展，包括多倍体（18.3%未治疗，8.1%治疗）和骨质疏松症（小梁骨体积；0.30 mm三在治疗的进展期小鼠中与0.14mm三在未经治疗的小鼠中，皮质骨体积；0.30毫米三在治疗的进展期小鼠中与0.22mm三在未经治疗的小鼠中）。神经异常的发生被延迟（约5周），其严重程度降低，总体上保持健康，而不影响寿命。

结论：这项研究对衰老过程中组织生长和维持组织功能是不相容的机制这一观点提出了质疑。它强调了未来研究的必要性，以评估基于肌抑制素/激活素阻断的治疗方法的潜力，以降低发病率并促进健康老龄化。

关键词：老龄化；骨骼；压缩；肾；肝脏；发病率；肌生长抑制素；神经病学；类前体；骨骼肌。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
sActRIIB治疗可以减轻身体、整个动物的活动、握力、损失和错误代码1 Δ/−老鼠。（A） 体重随时间的相对变化。腹膜内注射错误代码1 Δ/−sActRIIB在第7周开始，第15周结束时收集组织。通过活动笼测量生物体活动。第14周结束时进行的测量（B–E）。（F） Rotarod活动。（G） 通过评估握力来测量肌肉收缩。（H）体外EDL特定部队评估。（一） EDL的一半松弛时间。第15周开始时（J）生长激素、（K）葡萄糖、（L）胰岛素和（M）胰岛素样生长因子-1的水平。（N） 第15周结束时的食物摄入和（O）相对食物摄入。n个=6只对照雄性小鼠，n个 = 5错误代码1 Δ/−未经治疗的雄性小鼠，以及n个 = 5错误代码1 Δ/−治疗雄性小鼠。所有分析均采用非参数Kruskal–Wallis检验，随后采用Dunn多重比较法，但（J）采用单向方差分析，随后采用Bonferroni多重比较检验*P（P）<0.05时**P（P） < 0.01, ***P（P）<0.001。指长伸肌；胰岛素样生长因子-1；sActRIIB，可溶性激活素受体IIB型。
图2
图2
定量和定性改进错误代码1 Δ/−骨骼肌通过sActRIIB治疗。（A） 第15周结束时的肌肉重量。（B） 肌肉质量恢复到胫骨长度。（C） 对后肢进行微计算机断层扫描，以可视化sActRIIB治疗后肌肉的增加错误代码1 Δ/−老鼠。（D–G）分配给特定肌球蛋白重链亚型的横截面纤维区域。（H） EDL和比目鱼肌的光纤数量增加错误代码1 Δ/−并在治疗后进一步增加。（I） 单纤维隔离后受损纤维的发生率。（J） 示例中的微撕裂（箭头）错误代码1 Δ/−EDL光纤。（K） 含有caspase 3表位的纤维占所有EDL和比目鱼肌纤维的百分比。（五十） EDL和比目鱼肌中核位于中央的纤维百分比。（M） 过度染色SDH纤维的量化。（N） 对照肌肉中的SDH和（O）错误代码1 Δ/−肌肉显示出过度染色的纤维（箭头）。（P） TA肌纤维中DHE荧光的定量。（Q） 控制TA纤维，在控制纤维体内使用少量DHE荧光。（右）错误代码1 Δ/−对照纤维体内DHE荧光升高的TA纤维。（S） 已处理错误代码1 Δ/−TA纤维在纤维体内几乎没有DHE荧光。n个=9只对照雄性小鼠，n个 = 8Ercc1型 Δ/−未经治疗的雄性小鼠，以及n个 = 8错误代码1 Δ/−治疗雄性小鼠。单纤维标尺50μm、SDH 100μm和DHE 20μm。采用Bonferroni的多重比较检验进行单因素方差分析*P（P）<0.05时**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001. 二氢乙硫醚；指长伸肌；可溶性激活素受体IIB型；琥珀酸脱氢酶；TA，胫骨前。
图3
图3
sActRIIB诱导快速糖酵解转化错误代码1 Δ/−肌肉。（A） EDL肌肉的MHC剖面图。（B–D）EDL MHCIIA/IIB光纤在三个队列中的分布，对照，错误代码1 Δ/−、和错误代码1 Δ/−用sActRIIB处理。（E） SDH‐EDL肌肉的阳性和阴性纤维剖面图。三个队列中的（F–H）SDH染色。（一） EDL毛细管密度的量化。（J–L）在三个队列中用CD-31鉴定EDL毛细血管。（M）血管生成基因、（N）PGC1α、（O）线粒体基因和（P）脂肪代谢调节因子的定量PCR分析。n个=所有队列为8。SDH 100μm和CD31 50μm的刻度。除（E）使用非参数Kruskal–Wallis检验和Dunn多重比较外，所有数据集均使用单向方差分析和Bonferroni多重比较检验*P（P）<0.05时**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001. 指长伸肌；MHC，肌球蛋白重链；琥珀酸脱氢酶；sActRIIB，可溶性激活素受体IIB型。
图4
图4
sActRIIB可防止错误代码1 Δ/−肌肉超微结构异常并支持关键应激指标的正常表达水平。所有电子显微镜（EM）纵向图像和定量测量均来自二头肌。（A） 控制肌肉的低倍图像。（B） 低功耗图像错误代码1 Δ/−肌肉。注意大间隙（黑色箭头）、不均匀的肌节宽度（红色箭头）、扩张的肌节线粒体（红色箭头的）、分裂的肌节（黑色箭头的）和中断的M线（蓝色箭头的）。（C） 经sActRIIB处理的低功耗图像错误代码1 Δ/−肌肉。（D） 高倍放大对照肌肉的肌节区，显示大小均匀的线粒体（黑色箭头）。（E） 肌群区线粒体增大Ercc1型 Δ/−肌肉（蓝色箭头）和缺失（蓝色箭头的）或微弱的Z线（黑色箭头的）。（F） 治疗后肉瘤区的高倍放大错误代码1 Δ/−小鼠显示较小的肌群线粒体（黑色箭头）。（G） 控制肌肉的肉瘤区显示致密线粒体（红色箭头）。（H） 肌膜下区域的扩张（蓝色箭头）和异常线粒体（蓝色箭头）错误代码1 Δ/−肌肉。（一） 治疗的肉瘤区域错误代码1 Δ/−小鼠线粒体致密（红色箭头）。（J，K）肌角细胞（梭内）和膜下线粒体密度测量。（L，M）膜下和肌聚体（梭内）线粒体尺寸测量。（N） 腓肠肌线粒体未折叠蛋白反应基因的表达。（O） 腓肠肌中炎症基因的表达。（P） 的表达式抗增殖蛋白腓肠肌基因。（Q） 表达H3K9me3和（R）H4K20me3的EDL纤维的定量。EM研究n个=6–7，适用于所有队列。所有其他措施n个=8–9，适用于所有队列。非参数Kruskal–Wallis检验，然后是（N，O）中使用的Dunn多重比较，其余的采用单向方差分析，然后是Bonferroni的多重比较检验*P（P）<0.05时**P（P） < 0.01. 指长伸肌；sActRIIB，可溶性激活素受体IIB型。
图5
图5
标准化错误代码1 Δ/−细胞外成分及其卫星细胞的分化和自我更新。（A）肌萎缩蛋白用定量PCR（qPCR）测定基因表达。（B） 使用定量免疫荧光法以纤维类型特异的方式测量肌营养不良蛋白。（C） 测量IV型胶原蛋白通过qPCR进行表达谱分析。（D） EDL肌肉中肌营养不良蛋白表达的免疫荧光图像。（E） EDL肌肉IV型胶原表达的免疫荧光图像。n个=所有队列为7。（F） EDL肌核计数。（G） 新分离EDL纤维上卫星细胞的定量。（H） 培养72小时后EDL纤维上细胞的定量。（一） 控制，模拟处理错误代码1 Δ/−和经sActRIIB处理的错误代码1 Δ/−在72小时检测纤维中Myogenin（红色）和Pax7（绿色）的表达。箭头表示卫星细胞后代。（J） EDL分化的量化（Pax7−/肌生成素+)与干细胞（Pax7+/肌生成素−)培养72h后。从每个队列中的三只小鼠收集纤维，至少检查25根纤维。刻度50μm。非参数Kruskal–Wallis检验，然后是用于（A–C）的Dunn多重比较。其余数据采用单因素方差分析和Bonferroni多重比较检验进行分析*P（P）<0.05时**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001. 指长伸肌；sActRIIB，可溶性激活素受体IIB型。
图6
图6
sActRIIB治疗维持滤过屏障预防肾功能异常错误代码1 Δ/−老鼠。（A） 第14周结束时进行尿蛋白测定。（B–D）对照组、模拟治疗组足细胞的低倍和（F–H）高倍电子显微镜图像错误代码1 Δ/−和sActRIIB处理错误代码1 Δ/−老鼠。Pod表示足细胞。（C）错误代码1 Δ/−组织中含有自噬体（黄色箭头）和扩大的线粒体（黄色箭头方向）。（D） 经sActRIIB处理错误代码1 Δ/−小鼠出现一些足突消失（红色箭头），但有相当数量的成熟足突（红箭头）。（E） 足部处理宽度的量化。（F） 对照样品中有许多成熟的足部过程（红色箭头）。（G） 在错误代码1 Δ/−样本但肾小球基底膜增厚（红色箭头）。（H） 已处理错误代码1 Δ/−样本显示了许多成熟的足部突起（红色箭头）。（一） 肾小球基底膜厚度的定量。（J） Nephrin阳性结构域中的核尺寸测量。（K） pSmad2/3在对照小鼠（红色）中与足细胞的关系，通过Nephrin表达进行鉴定。（五十） pSmad2/3（红色箭头）的丰富水平错误代码1 Δ/−足细胞。（M） sActRIIB治疗的pSmad2/3点很少错误代码1 Δ/−足细胞（红色箭头）。n个=每个队列中检查了8只小鼠（A）和n个=每个队列中检查了5只小鼠（EM）。使用非参数Kruskal–Wallis检验进行分析，然后进行Dunn多重比较*P（P）<0.05时**P（P） < 0.01. sActRIIB，可溶性激活素受体IIB型。
图7
图7
sActRIIB可预防与年龄相关的发育性肝异常和骨质疏松表型错误代码1 Δ/−（A）肝细胞核大小的测量。（B） 多核肝细胞的剖面频率。（C） H3K9me3阳性肝细胞的频率。（D） H4K20me3阳性肝细胞的频率。（E） DHE荧光定量以测量超氧化物水平。（F） 线粒体基因表达的定量PCR分析。（G） 三个队列中H4K20me3分布的免疫荧光图像。（H） 三个队列中的DHE强度水平。（一） 小梁骨体积测量。（J） 小梁组织体积测量。（K） 小梁骨与组织的体积比。（五十） 小梁分离指数。（M） 小梁计数。（N） 小梁各向异性程度。（O） 小梁模式因子作为骨结构的量化指标。（P） 结构模型索引。（Q） 测量皮质骨体积。（R） 皮层组织体积测量。小梁骨体积测量。n个=（A–H）和n个=6只对照雄性小鼠，5只错误代码1 Δ/−未经治疗的雄性小鼠和6只Ercc1型 Δ/−在其他实验中处理雄性小鼠。对方差进行单向分析，然后使用Bonferroni的多重比较检验（A–F）和非参数Kruskal–Wallis检验，然后使用Dunn的多重对比检验（I–R）*P（P）<0.05时**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001. 二氢乙硫醚；sActRIIB，可溶性激活素受体IIB型。
图8
图8
sActRIIB延缓神经系统异常错误代码1 Δ/−不影响寿命的小鼠。（A，B）治疗后的体重变化（sActRIIB或模拟对照）错误代码1 Δ/−第二个试验点的老鼠(P（P） = 0.07). 第7周开始腹膜内注射。（C） 4个月大婴儿前肢和所有肢体的平均握力Ercc1型 Δ/−模拟和sActRIIB条件下的小鼠。（D） 加速转盘上花费的平均时间错误代码1 Δ/−每周监测不同处理的小鼠。（E–G）神经异常（F）震颤的发生(P（P）=0.28），（F）剧烈震颤(P（P）=0.0014）和（G）不平衡(P（P）=0.021）。（H） sActRIIB治疗和模拟治疗的存活率错误代码1 Δ/−老鼠(P（P） = 0.27).n个=每组10只动物。误差线表示平均值±SE。对数秩Mantel-Cox检验*P（P）<0.05时**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001. sActRIIB，可溶性激活素受体IIB型。
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