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.2019年6月；105(6):1225-1234.
doi:10.1002/JLB.3VMA0918-374R。 Epub 2019年3月25日。

生物来源的腺苷调节中性粒细胞胞外陷阱（NETs）

徐凯（Kai Xu） 1 2, 金伯利·A·库尼 1, 埃里克·Y·申 1, 王兰芳 1, 朱利安·德彭 1, 悉尼·C·金 1, 丽贝卡·德·莱维特 1
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生物来源的腺苷调节中性粒细胞胞外陷阱（NETs）

徐凯（Kai Xu）等。 白细胞生物学杂志. 2019年6月.

摘要

中性粒细胞胞外陷阱（NETs）与自身免疫性、血栓性、恶性和炎症性疾病有关；然而，人们对其在基础条件下的内源性调控知之甚少。中性粒细胞的炎症效应受到细胞外嘌呤（如腺苷（ADO））的调节，腺苷是抑制性的，ATP通常上调效应器功能。为了评估ADO对NETs的影响，从健康献血者的外周静脉血中分离出人类中性粒细胞，并刺激其产生NETs。ADO处理抑制了NET的生成，这通过两种方法进行量化：SYTOX绿色荧光和人类中性粒细胞弹性蛋白酶（HNE）-DNA ELISA分析。测试特定ADO受体激动剂和拮抗剂对NET生成的影响。ADO公司2安培受体（A2安培R） 激动剂CSG21680对NET的抑制程度与ADO相似，而a2安培R拮抗剂ZM241385阻止了ADO的NET抑制效应。此外，CD73是一种在间充质基质细胞（MSC）上表达的膜结合的外核苷酸酶，可以操纵组织（如骨髓）中的细胞外嘌呤。在共培养中评估MSCs对NET形成的影响。MSC以依赖CD73的方式减少了净形成。这些结果表明，细胞外嘌呤平衡可能局部调节神经营养不良，并可能被基质细胞主动调节以维持组织内环境稳定。

关键词：兴奋剂；敌手；炎症；受体；发出信号。

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利益冲突声明

披露

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。腺苷（ADO）抑制人类中性粒细胞胞外陷阱（NET）的形成。
将PMN接种到96周板上后，将ADO或NECA施加到培养基上30分钟，然后用324 nM PMA刺激。用ADO或其类似物NECA处理的中性粒细胞使用SYTOX绿色细胞非永久性DNA染料使较少的NET可视化(A类). ADO以剂量反应的方式抑制NET的形成(B类). SYTOX-Green的净量化(C类)染色和人中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA复合物ELISA(D类)ADO和NECA治疗显示出类似的NETosis抑制模式。(n个=7–15）数据表示为平均值±标准差*P（P）<0.05, ***P（P）<0.001. 使用单向方差分析和Tukey的事后分析进行统计分析
图2
图2。分离的人类中性粒细胞表达高水平的腺苷2安培受体亚型（A2安培R） ●●●●。
新鲜分离、固定人类中性粒细胞，并对其进行中性粒细胞特异性标记物髓过氧化物酶（MPO）和A的染色2安培R（右）(A类). 高细胞纯度和A2安培R表达。腺苷受体亚型转录物的定量PCR分析检测到a的优势2a个R成绩单(B类；n个= 7)
图3
图3。腺苷受体2a（A2安培R） 调节腺苷的抗NET作用。
用特异性A预处理中性粒细胞2安培PMA刺激前使用R激动剂CSG21680或拮抗剂ZM241385。使用5进行治疗μA中的M2安培R-特异性激动剂CGS21680抑制NET形成的程度与SYTOX绿检测到的ADO相似(A类)和ELISA(D类) (n个= 6–7). A预处理2安培拮抗剂（ZM 241385，1μM） SYTOX绿逆转腺苷和NECA对NETOS的抑制作用(B类和C类)和HNE-DNA ELISA(E类和F类；n个= 4–8). 数据表示为平均值±SD*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001. 使用单向方差分析和Tukey的事后分析进行统计分析
图4
图4。腺苷（ADO）受体A亚型的激动剂和拮抗剂1，A2B型、和A三对中性粒细胞胞外陷阱（NET）产生的影响不一致。
用特异性ADO受体激动剂预处理中性粒细胞30分钟，并使用SYTOX绿色分析法分析净产物。两者都是A1受体激动剂，2′-MeCCPA（10μM） 和老人牌汽车（1μM） ，A的激动剂三受体，未能显著降低PMA诱导的NET生成(A类；n个= 4–9). 然而，BAY60–6583（50 nM），A2B型受体激动剂，通过SYTOX绿色荧光显著抑制PMA后NET的形成(A类；n个= 5–9). 为了证实这些发现，我们测试了A2B型更特异的HNE-DNA ELISA对NET形成的激动剂效应(B类)，A对其无NET抑制作用2B型激动。此外，A2B型-特异性拮抗剂MRS1754（100 nM）和A三-特异性拮抗剂MRS3777（100 nM）对阻断ADO或NECA诱导的NET抑制无效(C类；n个= 5–7). 数据表示为平均值±SD*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001. 使用单向方差分析和Tukey的事后分析进行统计分析
图5
图5。间充质基质细胞（MSCs）在体外抑制中性粒细胞胞外陷阱（NET）的形成。
在用PMA刺激前，将人类中性粒细胞与MSCs共培养30分钟。SYTOX绿色荧光染色(A类)PMA给药后2小时，细胞外DNA增加，与MSCs共培养的细胞减少。不含中性粒细胞的MSCs未显示荧光（未显示）。绿色荧光定量(B类；n个=18）以及HNE-DNA ELISA检测(C类)显示MSC的强烈NET抑制作用(n个=13）。数据表示为平均值±SD***P（P）<0.001使用成对t吨-测试分析
图6
图6。间充质基质细胞衍生腺苷（ADO）是中性粒细胞胞外陷阱（NET）抑制的关键机制。
MSCs用100个预处理过夜μM APCP是CD73的一种非水解抑制剂。条件培养基的HPLC分析表明，如果不添加CD73底物AMP，则不会产生ADO(A类). 用APCP治疗MSC后，细胞外AMP产生的腺苷几乎完全受损(A类). SYTOX绿色荧光定量显示APCP削弱MSCs抑制NET生成的能力(B类；n个= 10). 通过人类中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA ELISA，APCP–MSC处理的PMN组的相对抑制率与CD73活性MSC处理组相比显著降低(C类；n个= 7). 数据表示为平均值±SD*P（P）<0.05, ***P（P）<0.001. 使用单向方差分析和Tukey的事后分析进行统计分析
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