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.2019年5月；52（3）：e12606。

doi:10.1111/cpr.12606。 Epub 2019年3月21日。

胃癌中USP33表达降低降低Slit2-Robo1信号对细胞迁移和EMT的抑制作用

夏一文¹, 王林军¹, 徐志鹏¹, 孔瑞瑞², 王飞（音译）², 凯因³, 徐江浩¹, 李伯文（Bowen Li）¹, 中原河¹, 卢旺（Lu Wang）¹, 郝旭¹, 张殿才¹, 李阳¹, 简·Y·吴^2 4 5, 徐泽宽^1 6

附属公司

附属公司

¹南京医科大学第一附属医院胃外科，南京，中国。
²中国科学院生物物理研究所脑与认知科学国家重点实验室，北京。
³江苏大学附属医院普外科，镇江，中国。
⁴伊利诺伊州芝加哥西北大学范伯格医学院遗传医学中心神经病学系。
⁵伊利诺伊州芝加哥卢里癌症中心遗传医学中心神经病学系。
⁶南京医科大学公共卫生学院江苏省癌症生物标志物与防治重点实验室，江苏省癌症个性化医学协同创新中心，南京，中国。

PMID： 30896071
预防性维修识别码： PMC6536419型
内政部： 10.1111/cpr.12606

胃癌中USP33表达降低降低Slit2-Robo1信号对细胞迁移和EMT的抑制作用

夏一文等。细胞Prolif. 2019年5月.

.2019年5月；52（3）：e12606。

doi:10.1111/cpr.12606。 Epub 2019年3月21日。

作者

附属公司

¹南京医科大学第一附属医院胃外科，南京，中国。
²中国科学院生物物理研究所脑与认知科学国家重点实验室，北京。
³江苏大学附属医院普外科，镇江，中国。
⁴伊利诺伊州芝加哥西北大学范伯格医学院遗传医学中心神经病学系。
⁵伊利诺伊州芝加哥卢里癌症中心遗传医学中心神经病学系。
⁶南京医科大学公共卫生学院江苏省癌症生物标志物与防治重点实验室，江苏省癌症个性化医学协同创新中心，南京，中国。

PMID： 30896071
预防性维修识别码： PMC6536419型
内政部： 10.1111/cpr.12606

中的勘误表

修正了“胃癌中USP33表达降低降低Slit2-Robo1信号对细胞迁移和EMT的抑制作用”。
[未列出作者] [未列出作者] 细胞增殖。2024年3月15日：e13632。doi:10.1111/cpr.13632。打印前在线。细胞增殖。2024 PMID：38487955 没有可用的摘要。

摘要

目标：胃癌是世界上最常见的癌症之一，每年都会造成大量死亡。Slit-Robo信号通路最初因其在神经引导中的关键作用而被发现，最近研究表明，它可以调节几种人类癌症的肿瘤侵袭和转移。然而，Slit-Robo信号的作用及其在胃癌发病机制中的分子机制仍有待阐明。

材料和方法：在从Oncomine数据库获得的数据集中分析Slit2、Robo1和USP33的表达，并在人类胃癌标本中进行测量。在体外和体内研究了Slit2-Robo1-USP33信号转导对胃癌细胞迁移和上皮-间充质转化（EMT）的作用。通过co-IP和泛素化蛋白分析，探讨了Robo1与USP33相互作用的机制。

结果：与邻近健康组织相比，GC组织中Slit2和Robo1的mRNA和蛋白质水平较低。重要的是，Slit2以机器人依赖的方式抑制GC细胞迁移并抑制EMT过程。Slit2-Robo1的抑制功能由泛素特异性蛋白酶33（USP33）通过去泛素化和稳定Robo1介导。GC组织中USP33表达降低，USP33水平降低与患者生存率低相关。

结论：我们的研究揭示了Slit-Robo信号在GC中的抑制功能，并揭示了USP33通过增强Slit2-Robo1信号在抑制癌细胞迁移和EMT中的作用。USP33作为GC的预后生物标志物是一个可行的选择。

关键词：EMT；机器人1；狭缝2；USP33；胃癌；迁移和入侵。

©2019作者。John Wiley&Sons Ltd.出版的《细胞增殖》。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者没有利益冲突需要声明。

数字

图1
胃癌中Slit2和Robo1的表达下调。（A和B）分析了来自Oncomine的TCGA和Deng数据集中Slit2表达和Robo1表达(http://www.oncomine.org). 方框和胡须图：线表示中值，方框表示第25和75个百分位，胡须表示第10和90个百分位数，圆点表示最大值和最小值。P（P）使用Student的t吨测试。Ctrl，控制胃组织；胃腺癌；DGAD，弥漫性胃腺癌。（C）通过qRT-PCR分析54对GC和邻近组织中Slit2 mRNA的表达。（D）通过qRT-PCR分析54对GC和邻近组织中Robo1 mRNA的表达。（E） 12对GC和邻近组织中Robo1免疫组织化学（IHC）染色的代表性图像。原始放大倍数，200×；比例尺：100µm。（F）方框图显示了Mann‐Whitney分析的Robo1蛋白表达的IHC得分U型测试。（G）通过Western blotting测定6个随机配对GC和相邻组织中的Robo1蛋白水平。（H）蛋白质印迹法检测5种胃细胞系和正常人胃上皮细胞系GES-1中Robo1蛋白的表达。（一） qRT-PCR检测5种胃细胞系和正常人胃上皮细胞系GES-1中Robo1 mRNA的表达

图2
Slit2以机器人依赖的方式抑制GC细胞的迁移，并抑制EMT标记。A、在含有模拟对照（Ctrl）、Slit2和Slit2以及RoboN的培养基中，使用MGC‐803细胞在伤口愈合试验中检测细胞迁移。原始放大倍数，40倍；比例尺：100µm。B、通过伤口愈合试验测试BGC‐823细胞的迁移。C、 MGC‐803细胞迁移距离的量化。D、 BGC‐823细胞迁移距离的量化。E、在转染Slit2质粒或对照的MGC‐803和BGC‐823细胞中，通过跨阱分析检测细胞迁移。原始放大倍数，100×；比例尺：200µm。F、在跨阱分析中检测MGC‐803和BGC‐823细胞的细胞侵袭性。G、对细胞迁移进行量化。H、量化细胞侵袭。一、用免疫荧光显微镜检测转染Slit2质粒或对照的MGC-803和BGC-823中E-cadherin（红色）和vimentin（绿色）的表达，DAPI（蓝色）用于核染色。原始放大倍数，400×；比例尺：50µm。J、通过Western blotting分析上皮细胞标记物（E-cadherin）、间充质细胞标记物和相关转录因子（蜗牛、斯拉格）的表达。GAPDH被用作内部控制。所有数据均显示为平均值±SEM，并由学生分析t吨测试*P（P）<0.05时**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001

图3
GC中USP33表达下调，USP33与Robo1表达相关。在来自Oncomine的TCGA和Deng数据集中分析USP33的表达。（C）通过qRT-PCR分析54对GC和邻近非癌组织中USP33 mRNA的表达。（D）线性回归分析用于检查人类GC组织中Robo1和USP33 mRNA表达水平之间的相关性。第页 = 0.449,P（P）<0.001，n=54。（E） USP33在12对GC和相邻组织中的IHC染色的代表性图像。原始放大倍数，200×；比例尺：100µm。（F）方框图显示了Mann‐Whitney分析的Robo1蛋白表达的IHC得分U型测试。（G）通过Western blotting测定6对GC组织（T）和相邻非癌组织样品（N）中的USP33蛋白水平。（H） Western blotting检测五种胃细胞系和正常人胃上皮细胞系GES-1中USP33蛋白的表达。（一）通过qRT-PCR检测5种胃细胞系和正常人胃上皮细胞系GES-1中USP33 mRNA的表达。（J） cBioPortal不同数据集中的拷贝数改变（CNA）和USP33基因突变或缺失频率(http://www.cbioportal.org). （K）胃腺癌USP33突变跨蛋白结构域的分布

图4
USP33与Robo1相互作用，并通过在GC细胞中对Robo1进行去平衡处理来提高Robo1的稳定性。A、通过qRT-PCR检测转染对照siRNA、siUSP33#1或siUSP33#2的MGC-803和BGC-823中USP33 mRNA的相对水平。B、转染对照siRNA或siUSP33的MGC‐803和BGC‐823细胞中的相对Robo1 mRNA水平。C、 Western blotting显示转染对照siRNA或siUSP33的MGC‐803和BGC‐823细胞中USP33和Robo1的蛋白水平。D、 MGC‐803细胞中Robo1和USP33蛋白的相互作用。使用对照IgG或抗Robo1抗体进行共免疫沉淀。使用抗Robo1和抗USP33通过Western blotting检测免疫沉淀蛋白。E、用对照siRNA或siUSP33转染MGC‐803细胞，并用环己酰亚胺（CHX，50μg/mL）处理不同时间段。对Robo1和USP33蛋白水平进行蛋白质印迹分析。F、相对Robo1蛋白水平的量化。G、 MGC‐803细胞未经处理或用氯喹（CHQ，50μmol/L，10小时）或MG132（10μmol/L，10小时）处理，并通过蛋白质印迹检测Robo1。H、转染对照siRNA或siUSP33的MGC‐803细胞用MG132（10μmol/L）处理或未处理，10小时后，从细胞裂解液中检测到Robo1和USP33。一、在与Flag‐ubiquitin、对照siRNA或siUSP33共转染的MGC‐803细胞中检测Robo1泛素化。用MG132处理后（10μmol/L，10 h）用抗Robo1进行共免疫沉淀，然后用Western blotting检测。TCL：总细胞裂解物。图4中的所有Western blotting分析均使用GAPDH作为内部控制

图5
USP33在体外介导Slit2信号抑制GC细胞迁移和EMT.A、在伤口愈合试验中检测了表达Slit2、Slit2+shUSP33或对照的MGC‐803细胞的迁移。原始放大倍数，40倍；比例尺：200µm。B、在伤口愈合试验中检测了BGC‐823细胞的迁移。C、 MGC‐803细胞迁移距离的量化。D、 BGC‐823细胞迁移距离的量化。E、在跨阱分析中检测MGC‐803和BGC‐823细胞的迁移。原始放大倍数，100倍；比例尺：200µm。F、在transwell分析中检测MGC‐803和BGC‐823细胞的侵袭性。G、计算迁移细胞的数量。H、计算侵入细胞的数量。一、用免疫荧光显微镜检测表达Slit2、Slit2+shUSP33或对照的MGC-803和BGC-823细胞中E-cadherin（红色）和vimentin（绿色）的表达，并用DAPI（蓝色）进行核染色。原始放大倍数，400×；比例尺：50µm。J、通过Western blotting分析上皮细胞标记物（E-cadherin）、间充质细胞标记物和相关转录因子（蜗牛、斯拉格）的表达。GAPDH被用作内部控制。所有数据均显示为平均值±SEM，并由学生分析t吨测试*P（P）<0.05时**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001

图6
USP33介导Slit2信号在体内GC转移中的抑制作用，USP33低表达预示患者生存期缩短。（A） MGC‐803细胞稳定表达Slit2、Sli2+shUSP33或对照（1×10⁶将100μL PBS中的细胞注入4周龄雌性BALB/c裸鼠（每组6只）的尾静脉。使用IVIS成像系统监测肿瘤进展和转移。注射6周后对小鼠实施安乐死，并采集肺组织进行苏木精-伊红（HE）染色。显示了具有代表性的小鼠生物发光图像和肺组织HE染色图像。原始放大倍数，200×；比例尺：100µm。（B）小鼠生物发光图像的代表性图像和注射BGC‐823的肺组织的HE染色。原始放大倍数，200×；比例尺：100µm。（C）注射MGC‐803细胞的小鼠转移灶的量化。（D）注射BGC‐823细胞的小鼠转移灶的量化。（E，F）通过TCGA数据库的GC队列，进行基因集富集分析（GSEA），比较Slit2较高组（红色）和Slit2较低组（蓝色）。较高的Slit2表达与转化生长因子β受体信号通路的负调控和通路限制性Smad蛋白磷酸化的正调控相关。（G）通过Western blotting检测TGFβ途径中关键蛋白的表达。（H‐J）基于三个独立数据集（TCGA、GSE62254和GSE15459）中USP33表达的患者生存分析。总体生存分析通过危险率和对数秩检验显示P（P）‐值

图7
描述USP33在GC细胞中调节Slit2‐Robo1信号传导抑制功能的工作模型的图表。在GC细胞中，Slit2与Robo1结合，抑制细胞迁移和EMT。USP33与Robo1相互作用，通过去平衡Robo1并阻止其泛素蛋白酶体介导的降解来调节Slit2‐Robo1信号

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