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.2019年3月20:8:e39578。
doi:10.7554/eLife.39578。

应激颗粒的慢性光遗传诱导具有细胞毒性，揭示了ALS-FTD病理学的演变

张培培 1, Baochang Fan公司 1, 杨培国 1, 贾姆希德·特米洛夫 1, 詹姆斯·梅辛 2, 金洪珠（Hong Joo Kim） 1, J保罗·泰勒 2
附属机构

应激颗粒的慢性光遗传诱导具有细胞毒性，揭示了ALS-FTD病理学的演变

张培培等。 埃利夫. .

摘要

应激颗粒（SG）是一种非膜结合的RNA-蛋白颗粒，在细胞应激下通过相分离进行组装。SG动力学紊乱被认为是神经退行性疾病的主要驱动因素，包括肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTD），这表明这些疾病反映了SG动力学和物质特性的潜在紊乱。然而，这一概念在SG组装的现有模型中基本上无法验证，因为这些模型需要外源性应激源的混杂变量。在这里，我们介绍了一种光诱导SG系统，称为OptoGranules，该系统基于G3BP1的光遗传多重聚合，G3BPl是SG组装所必需的支架蛋白。在这个系统中，允许在没有外源性应激源的情况下对活细胞中的SG进行实验性控制，我们证明SG的持续或重复组装具有细胞毒性，并伴随着SG向细胞质内含物的演变，再现了ALS-FTD的病理学。

编辑注释：本文经过了一个编辑过程，作者决定如何回应同行评审中提出的问题。审查编辑的评估是，所有问题都已解决（见决定书）。

关键词：ALS；FTD；TDP-43；细胞生物学；人；视颗粒；相分离；应力颗粒。

PubMed免责声明

利益冲突声明

PZ、BF、PY、JT、JM、HK没有宣布竞争利益，JT Review编辑、eLife和Third Rock Ventures的顾问。

数字

图1。
图1.OptoGrants是光诱导的动态应激颗粒。
(一)设计Opto-G3BP1和Opto-Control结构。(b)用488 nm蓝光（功率密度~2.5 MW/cm）的5毫秒脉冲刺激稳定表达Opto-Control或Opto-G3BP1的U2OS细胞2)在定义的ROI中。有代表性的图像来自n=3个独立实验。(c（c）)按中处理的单元格中数据的量化(b). 对五个表达水平相似的细胞进行计数。颗粒数与OptoGranule组装峰值的颗粒数相对应。误差条代表标准误差(d-f型)用Opto-Control或Opto-G3BP1稳定转染U2OS细胞，或用G3BP1-GFP瞬时转染稳定的Opto-G3GP1细胞，并用蓝光激光（功率密度约4.5 W/cm）刺激2)持续3分钟。对标有黄色圆圈的区域进行光漂白，并监测其荧光恢复情况。数据显示为代表性图像(d日)，光漂白区域随时间的相对荧光强度(e（电子）)，以及从中得出的相对流动分数(e（电子）) (如果). 对于(e、 （f）)n=15个光电控制单元；对于Opto-G3BP1，n=12；对于G3BP1-GFP，n=14。数据代表n=3个独立实验。数据显示为平均值+标准差ns，通过Dunnett检验的单因素方差分析不显著。(克)瞬时转染Opto-G3BP1和应力颗粒标记GFP-TIA1的U2OS细胞用蓝光激光（功率密度~2.5MW/cm）刺激2)持续5毫秒。细胞通过561nm和488nm通道依次成像；我们注意到用于成像的488 nm通道也激活Opto-G3BP1（功率密度2.2 W/cm2). 从n＝3个独立实验中显示了代表性图像。(h-j型)在没有或使用持续蓝光（~2 mW/cm）的情况下，刺激稳定表达Opto-Control或Opto-G3BP1结构的U2OS细胞6小时2)使用定制的LED阵列进行全局激活。用PABP抗体对细胞进行免疫染色(小时)，TDP-43抗体(我)或使用FAM标记的寡核苷酸（dT）20作为探针的RNA荧光原位杂交(j个). 所有显微照片中的比例尺为10µm。
图1——图补充1。
图1-图补充1.Opto-G3BP1组装光依赖性细胞质簇。
(一)上图：免疫印迹显示在有或无蓝光刺激下稳定表达Opto-Control或Opto-G3BP1的U2OS细胞中mCherry（红色）和G3BPl（绿色）的表达水平。底部：顶部免疫印迹定量。n=3个独立实验显示了代表性印迹。数据显示为平均值+s.e.m.ns，经t检验不显著。(b)稳定表达Opto-G3BP1的U2OS瞬时转染HA-FUS-R521C、FLAG-TDP-43-ΔNLS或GFP-TIA1-A381T。有代表性的图像来自n=3个独立实验。c、，用Opto-Control（olig）和应激颗粒标记GFP-TIA1瞬时转染U2OS细胞，并用蓝光刺激5msec（功率密度~2.5MW/cm2). 细胞通过561nm和488nm通道依次成像；我们注意到用于成像的488 nm通道也激活Opto-G3BP1（功率密度2.2 W/cm2). 有代表性的图像来自n=3个独立实验。(d日)用光控（olig）瞬时转染的U2OS细胞用488nm蓝光（功率密度~2.5 MW/cm）的单个5秒脉冲刺激2)在定义的ROI中。有代表性的图像来自n=3个独立实验。(电子-传真)U2OS细胞瞬时转染Opto-Control（olig）并用488 nm激光（功率密度约4.5 W/cm）刺激2)持续3分钟。对标有黄色圆圈的区域进行光漂白，并监测其荧光恢复情况。数据显示为随时间变化的光漂白区域的代表性图像和相对荧光强度(e（电子）)，以及从n=10个细胞得出的相对流动分数(如果). 数据代表n=3个独立实验。数据显示为平均值+标准偏差比例尺，所有显微照片中为10μm。
图1—图补充2。
图1补充图2。OptoGranules是光诱导应激颗粒。
(a至g)稳定表达Opto-G3BP1的U2OS细胞，有或没有持续蓝光（~2 mW/cm2)使用定制的LED阵列5小时，用TIA1抗体进行免疫染色(一)、TIAR(b)，eIF4G(c（c）)，eIF3η(d日)，ataxin 2(e（电子）)，GLE1(如果)，或FUS(克). 有代表性的图像来自n=3个独立实验。所有显微照片中的比例尺为10μm。
图1——图补充3。
图1—补充图3。OptoGranules拯救应激颗粒形成G3BP1/2双KO电池。
(a-h（a-h）,) (一)WT U2OS电池（顶部）和G3BP1/2双KO U2OS电池（底部），有或没有亚砷酸钠（0.5 mM NaAsO2，45分钟）处理对G3BP1以及应激颗粒标记物TIA1、PABP、TIAR和TDP-43进行免疫染色。有代表性的图像来自n=3个独立实验。(b)G3BP1/2将Opto-Control（左）、Opto-G3BP1（中）或Opto-G3GP2（右）构建物瞬时转染双KO细胞，暴露于6小时连续蓝光（~2 mW/cm2)使用定制的LED阵列，并对应激颗粒标记物PABP进行免疫染色。有代表性的图像来自n=3个独立实验。(c（c）)PABP阳性应激颗粒的定量(b). 数据代表n=3个独立实验。
图1——图补充4。
图1补充图4。OptoDroplets不是应力颗粒。
(一)Opto-FUS（左）和Opto-TDP-43（右）结构示意图。(b)U2OS细胞与应激颗粒标记物G3BP1-GFP以及Opto-FUS-IDR或Opto-TDP-43-IDR瞬时共转染。用蓝光激光（功率密度~2.5 MW/cm）刺激细胞2)持续5毫秒，并通过561nm和488nm通道成像。有代表性的图像来自n=3个独立实验。(c（c）)用Opto-FUS-IDR或Opto-TDP-43-IDR瞬时转染U2OS细胞，并在持续蓝光（~2 mW/cm）前后成像2)通过PABP抗体免疫染色，使用定制LED阵列刺激2小时。(d、 e（电子）)用Opto-FUS-IDR瞬时转染U2OS细胞(d日)或Opto-TDP-43-IDR(e（电子）)并在连续蓝光（~2 mW/cm）前后成像2)通过使用SQSTM1（顶部）、VCP（中部）或OPTN（底部）抗体进行免疫染色，使用定制LED阵列刺激5小时。(f、 克)用Opto-FUS（1–371 aa）或Opto-FUS1（全长）瞬时转染U2OS细胞(如果)或Opto-TDP-43（106–414个氨基酸）或Opto-TDP-43（全长）(克)并在连续蓝光（~2 mW/cm）前后成像2)通过应激颗粒标记物PABP免疫染色，使用定制LED阵列刺激2小时。(小时)Opto-TIA1结构示意图。(我)U2OS细胞瞬时联合转染Opto-TIA1（全长）或Opto-TIA2（1–267 aa）和应力颗粒标记物G3BP1-GFP，并用蓝光激光（功率密度~2.5 MW/cm）刺激2)5msec，561nm和488nm通道成像。(j个)用Opto-TIA1（1–267 aa）瞬时转染U2OS细胞，并在持续蓝光（~2 mW/cm）前后成像2)通过使用SQSTM1（顶部）、VCP（中部）或OPTN（底部）抗体进行免疫染色，使用定制LED阵列刺激5小时。有代表性的图像来自n=3个独立实验。所有显微照片中的比例尺为10μm。
图2。
图2 OptoGranule的形成依赖于活化G3BP1的局部浓度和多聚体的分解，但与eIF2α磷酸化无关。
(一)将稳定表达Opto-G3BP1的U2OS细胞间歇性暴露于蓝光激光（488 nm）下进行激活，然后使用561 nm通道进行图像采集。蓝光强度从上到下依次增加（488 nm功率密度测量从上到底：1%，0.02 W/cm2; 5%，0.04 W/cm2; 25%，0.95 W/cm2; 75%，5.5 W/cm2). 有代表性的图像来自n=3个独立实验。(b)按中处理的单元格中数据的量化(一). 误差线代表s.d(c（c）)将不同表达水平Opto-G3BP1的U2OS细胞间歇性暴露于488nm蓝光激光（90%激光功率，功率密度6.3W/cm2)然后使用561nm通道进行图像采集。从上到下的相对表达水平：0.19、0.32、0.78和1 a.u。代表性图像来自n=3个独立实验。(d日)按中处理的单元格中数据的量化(c（c）). (e（电子）)用环己酰亚胺（CHX）或ISRIB预处理稳定表达Opto-G3BP1的U2OS细胞30分钟，然后暴露于亚砷酸钠（0.5 mM NaAsO）中45分钟2)或6小时连续蓝光（~2 mW/cm2)使用定制的LED阵列进行全局激活，并用PABP抗体进行免疫染色。(如果)颗粒阳性细胞的定量(e（电子）). 数据显示为n=3个独立实验的平均值±标准偏差****p<0.0001；ns，经Tukey后验单因素方差分析无显著性。(克)免疫印迹显示用亚砷酸钠（0.5 mM NaAsO）处理的细胞中磷酸化eIF2α（P-eIF2）、eIF2β和肌动蛋白水平2)持续45分钟，暴露在42°C的热冲击下1小时，或用蓝光激活6小时。序列探头图像也参见图2补充图1。所有显微照片中的比例尺为10μm。
图2-图补充1。
图2-图补充1.OptoGrant的形成与eIF2α磷酸化无关。
免疫印迹显示用亚砷酸钠（0.5 mM NaAsO）处理的细胞中磷酸化eIF2α和肌动蛋白水平2)45分钟，暴露于42°C热冲击1小时，或暴露于持续蓝光（~2 mW/cm2)使用定制LED阵列刺激6小时。第一轮主要抗体是抗肌动蛋白（山羊）和抗磷酸化eIF2α（兔子），它们是使用相应的荧光二级抗体（肌动蛋白：IRDye 800CW[绿色]驴抗山羊；磷酸化eIF2α：IRDyer 680RD[红色]驴抗兔）开发的。隔夜清洗后，用抗eIF2α（小鼠）一级抗体和IRDye 800CW（绿色）驴抗小鼠二级抗体重新缝合膜。
图3。
图3：持久性OptoGranules具有细胞毒性，并演变为病理性包涵体。
(a、 b条)用持续蓝光（~2 mW/cm）刺激稳定表达Opto-Control或Opto-G3BP1的U2OS细胞2)使用定制的LED阵列进行指示时间，并通过结晶紫染色评估生存能力(一)或CellTiter-Glo2.0发光(b). 晶须代表从n=9个生物重复中的最小值到最大值****p<0.0001。；ns，经Tukey后验双向方差分析无显著性。(c、 d日)稳定表达Opto-Control或Opto-G3BP1的U2OS细胞暴露于慢性持续性(c（c）)或慢性间歇性(d日)蓝光（445 nm）刺激和活细胞成像（功率密度~0.12 W/cm2)如示意图（左）所示，并通过计数活细胞（右）评估细胞存活率。示意图中的蓝色方框表示光感应的时间；红线是细胞反应的理想曲线。慢性持续性范式：Opto-Control组n=26，Opto-G3BP1组n=28。慢性间歇性范式：Opto-Control的n=7，Opto-G3BP1的n=10。数据来自n=3个独立实验****通过log-rank（Mantel-Cox）测试，p<0.0001。(e（电子）)U2OS细胞中OptoGranules中蛋白质积累的时间线。(f小时)用持续蓝光（~2 mW/cm）刺激稳定表达Opto-G3BP1的U2OS细胞2)使用定制LED阵列并与p-TDP-43和A11抗体共同免疫染色，用于指定时间(如果)、SQSTM1和泛素抗体(克)或VCP和TDP-43抗体(小时). (我)量化数据(f-h（飞行高度）). 误差条代表s.e.m。f-h中的图像代表n=3个独立实验***通过Dunnett检验的单向方差分析，TDP-43的p=0.0002（2小时），***p=0.0001（3小时），A11的***p=0.0048（2小时。所有显微照片中的比例尺为10μm。
图3——图补充1。
图3补充1。OptoGranules演变为病理性包涵体。
(一)将稳定表达Opto-G3BP1的U2OS细胞暴露于慢性持续蓝光刺激（与图3c所示数据相同）或慢性间歇性蓝光刺激下（与图3d所示数据一致）。ns，经log-rank（Mantel-Cox）检验不显著。(b)用持续蓝光（~2 mW/cm）刺激稳定表达Opto-Control的U2OS细胞2)使用定制LED阵列4小时，然后对A11进行免疫染色。有代表性的图像来自n=3个独立实验。(c-d公司)如图3c所示，将稳定表达Opto-G3BP1的U2OS细胞暴露于慢性持续蓝光刺激下1-2小时（早期）或17小时（晚期）。在指定的时间点，相对流动分数(c（c）)和一半恢复时间(d日)使用FRAP测量Opto-G3BP1的含量。通过t检验，误差线代表s.d.**p<0.01，***p<0.001。(e（电子）)用持续蓝光（~2 mW/cm）刺激稳定表达Opto-G3BP1的U2OS细胞2)使用定制LED阵列4小时，然后对p-TDP-43进行免疫染色（P01）。有代表性的图像来自n=2个独立实验。(如果)用持续蓝光（~2 mW/cm）刺激稳定表达Opto-G3BP1的U2OS细胞2)使用定制的LED阵列指示时间，然后对TDP-43和p-TDP-43（M01）进行联合免疫染色。有代表性的图像来自n=3个独立实验。所有显微照片中的比例尺为10μm。
图4。
图4：持久性OptoGranules具有细胞毒性，并在人类iPSC-derived神经元中演变为病理包涵体。
(一)图示稳定表达Opto-G3BP1的iPSC-derived神经元的生成。(b)表达Opto-Control（mRuby）或Opto-G3BP1（mRube）的iPSC-derived神经元间歇性暴露于488nm蓝光激光（90%激光功率，6.3 W/cm功率密度）下2)然后使用561nm通道进行图像采集。有代表性的图像来自n=3个独立实验。(c（c）)如图3c所示，将表达Opto Control或Opto-G3BP1的iPSC衍生神经元暴露于慢性持续刺激，并通过计数活细胞来评估存活率。Opto-Control的n=35个单元，Opto-G3BP1的n=34个单元。数据代表n=3个独立实验****通过log-rank（Mantel-Cox）测试，p<0.0001。(d日)iPSC-derived神经元OptoGranules中病理性蛋白积聚的时间轴。(电子-小时)持续蓝光（~2 mW/cm）刺激表达Opto-G3BP1的iPSC衍生神经元2)使用定制LED阵列并与MAP2和TDP-43抗体共同免疫染色，用于指定时间(e（电子）)、MAP2和A11抗体(如果)、MAP2和p-TDP-43（P01）抗体(克)或泛素和SQSTM1抗体(小时). 图4中所示图像的线扫描，另请参见图补充件1e(小时).(我)来自e-h的数据的量化。误差条表示s.e.m。e-h中的图像表示n=3个独立实验*通过Dunnett检验的单向方差分析，SQSTM1的p=0.0489（2小时），***p=0.0001（5小时），pTDP-43的***p<0.0001。所有显微照片中的比例尺为10μm。
图4——图补充1。
图4补充1。iPSC-衍生神经元形成OptoGranules。
(ab公司)Ngn2慢病毒感染1周和2周前后iPSC-derived神经元mRNA水平的量化。标准化级别RPP30型mRNA水平作为内部控制。面板b以对数刻度显示。(c（c）)用0.25 mM亚砷酸钠处理iPSC-derived神经元30分钟或42°C热休克1小时，然后对MAP2以及应激颗粒标记物TIA1和TDP-43进行免疫染色。(d日)用持续蓝光（~2 mW/cm）刺激稳定表达Opto-Control（mRuby）或Opto-G3BP1（mRube）的U2OS细胞2)使用定制LED阵列2小时，然后对PABP进行免疫染色。(e（电子）)上图：图4h中的放大图像。底部：线扫描显示放大图像中绘制的线中Opto-G3BP1（红色）、泛素（紫色）和SQSTM1（绿色）之间的共定位程度。图像是n=3个独立实验的代表。所有显微照片中的比例尺为10μm。
图4——图补充2。
图4补充2。OptoGranules在iPSC-derived神经元中演变为病理性内含物。
(一)图示多西环素诱导分化和Opto-G3BP1（mCherry）表达的iPSC衍生神经元的生成。(b)表达多西环素诱导的Opto-Control（mCherry）或Opto-G3BP1（mCherly）的iPSC-derived神经元用一个5毫秒的蓝光激光脉冲（功率密度约2.5兆瓦/厘米）刺激2). 有代表性的图像来自n=3个独立实验。(立方英尺)表达多西环素诱导的Opto-G3BP1（mCherry）的iPSC-derived神经元用持续蓝光（~2 mW/cm）刺激2)使用定制的LED阵列并与MAP2和TDP-43抗体共同免疫染色(c（c）)、MAP2和A11抗体(d日)、泛素和SQSTM1抗体(e（电子）)或p-TDP-43（P01）抗体(如果). c-f中的图像代表n=3个独立实验。所有显微照片中的比例尺为10μm。
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