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.2019年3月18日；9(1):4789.
doi:10.1038/s41598-019-41249-3。

DNA聚合酶Ⅰ被乙酰化以响应SN个2种烷基化剂

朱斯特娜·麦金太尔 1, 亚历克桑德拉·索博列夫斯卡 2, 米科拉伊·费多罗维奇 2, 玛丽·P·麦克莱尼根 三, 马蒂尔达·马西亚斯 4, 罗杰·伍德盖特 三, Ewa Sledziewska-Gojska公司 2
附属公司

DNA聚合酶Ⅰ被乙酰化以响应SN个2种烷基化剂

朱斯特娜·麦金太尔等。 科学代表. .

摘要

DNA聚合酶iota（Polí）属于DNA聚合酶类Y家族，通过其在跨损伤DNA合成中的作用参与DNA损伤耐受。与所有其他Y家族聚合酶一样，Polí与增殖细胞核抗原（PCNA）、Rev1、泛素和泛素化PCNA相互作用，本身也泛素化。在这里，我们报告Polí也与p300乙酰转移酶相互作用并被乙酰化。主要乙酰化位点是K550，位于Rev1-相互作用区域。然而，K550氨基酸替换对Polí与Rev1相互作用的能力没有影响。有趣的是，我们发现Polι的乙酰化在对S的反应中显著而特异地增加N个2种烷基化剂，且程度较低为SN个1烷基化剂和氧化剂。由于我们还没有观察到Pol？最接近的副产物DNA聚合酶eta（Pol。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
绘制与PolⅠ相互作用的p300区域。(一)p300缺失结构的示意图。彩色区块代表p300中的一些重要结构域：Bd-溴代多巴胺、泛素连接酶的RING-非标准环结构域特征、PHD-植物同源结构域、HAT-乙酰转移酶催化结构域、AIL-自身抑制环。不同结构域的氨基酸位置显示在区块方案上方。使用的构造如下所示。(b条)波尔一和p300之间的相互作用。左面板显示了用抗FLAG树脂进行免疫沉淀分析（IP）的结果，该树脂与共表达p300-c-myc和FLAG-Pol或p300-c-myc的细胞提取物（E）孵育，空FLAG载体作为阴性对照。右侧面板显示了邻近连接分析（PLA）的结果，信号（红色）提供了证据，表明细胞内内源性Polí和p300紧密相连，肌动蛋白细胞骨架显示为绿色（Alexa488 Phalloidin染色），细胞核显示为蓝色（Hoechst染色）。比例尺为10 微米。(c（c）)免疫沉淀分析（IP）使用抗FLAG树脂进行，这些树脂与表达FLAG-PolⅠ或FLAG空载体的细胞提取物（E）孵育而成，作为阴性对照，并且HA-标记的p300缺失构建p300ΔN或p300△C。
图2
图2
绘制与p300相互作用的Polí区域。(一)Polí与指定域的示意图表示，以及Polá删除结构。(b条)用10μl抗-HA树脂进行免疫沉淀分析，这些树脂与等量的共同表达HA-p300ΔN的细胞提取物和全长FLAG-Pol或缺失了各种蛋白相互作用域的FLAG-Poll的细胞提取物孵育。(c（c）)用10μl抗-HA树脂进行免疫沉淀分析，这些树脂与等量的共同表达HA-p300ΔN的细胞提取物和缺乏N-末端催化域的全长FLAG-Pol或FLAG-Pol-的细胞提取物（IP-免疫沉淀）孵育。在(b条,c（c）)输入对照分别含有20μg或10μg蛋白质提取物。
图3
图3
体内和在体外p300对Polι的乙酰化作用。(一)对联合转染FLAG-PolⅠ和野生型p300-c-myc的HEK293T细胞提取物进行免疫沉淀分析。如前所述，在收获细胞之前，用二甲基亚砜或脱乙酰酶抑制剂（DKAc）混合物处理细胞。(b条)免疫沉淀法使用联合转染FLAG-PolⅠ和野生型p300-c-myc的HEK293T细胞的提取物，或含有消除p300乙酰转移酶活性的D1399Y突变的FLAG-Pol-Ⅰ和p300。收获前24小时，用DKAc抑制剂处理细胞。在面板中(一,b条)使用乙酰化赖氨酸（KAc）抗体通过western blot验证Polí乙酰化。使用抗PolⅠC末端片段的多克隆兔抗体观察PolⅠ。(c（c）)体外p300对重组His-tagged PolⅠ进行乙酰化。反应产物通过SDS-PAGE进行解析，并使用抗KAc和抗PolⅠ抗体进行western blot分析。
图4
图4
Polí中乙酰化位点的鉴定。(一)考马斯亮蓝染色凝胶（左面板），从转染了FLAG-Pol？质粒的HEK293T细胞中纯化出FLAG-tagged Pol？，并用DKAc抑制剂鸡尾酒处理或未处理，如图所示。使用抗乙酰化赖氨酸（KAc）的单克隆抗体，通过蛋白质印迹（右图）观察纯化的Polι的Polι乙酰化。使用抗PolⅠC末端片段的多克隆兔抗体观察PolⅠ。(b条)K550R取代对PolⅠ乙酰化的影响。使用抗乙酰化赖氨酸单克隆抗体进行Western blot。使用抗PolⅠC末端片段的多克隆兔抗体观察PolⅠ。
图5
图5
PolíK550残基突变的影响及其与Rev1的相互作用。(一)Rev1和野生型Polí或Pol⁄K550突变体的免疫沉淀。使用固定在抗-HA树脂上的HA标记全长Rev1进行免疫沉淀分析，该树脂与表达FLAG标记的野生型Pol？或携带单K550R或双K549R/K550R突变的Pol？细胞提取物孵育。(b条)Rev1和模拟K550乙酰化的野生型Polí或Polá突变体的免疫沉淀。使用固定在抗-HA树脂上的HA标记全长Rev1进行免疫沉淀分析，该树脂与表达FLAG标记的野生型Pol？或携带单K550Q或双K549Q/K550Q突变的Pol？细胞提取物孵育。作为对照，显示Rev1和PolíF546A/F547A之间缺乏相互作用。E提取物，IP免疫沉淀。
图6
图6
DNA损伤剂对HEK293T细胞PolⅠ乙酰化的影响。(一)转染FLAG-PolⅠ表达载体的HEK293T细胞中PolⅠ的乙酰化，如图所示，经紫外线照射-7处理 焦耳/米2、彩信–1 h、 zeocin–12小时，过氧化氢（h2O（运行）2) – 1 h、 丝裂霉素C（MMC）-40小时，顺铂（顺铂）-12小时 h、 或羟基脲（HU）。在每个品系中加载10μg蛋白质提取物。使用抗乙酰化赖氨酸（KAc）单克隆抗体通过western blot观察PolⅠ乙酰化。使用抗PolⅠC末端片段的多克隆兔抗体观察PolⅠ。(b条)转染FLAG-PolⅠ质粒的HEK293T细胞中PolⅠ的乙酰化反应 随着氧化剂过氧化氢（h2O（运行）2)或溴酸钾（KBrO三). (c（c）)转染FLAG-PolⅠ质粒的HEK293T细胞中PolⅠ的乙酰化反应 h使用烷基化剂、MMS、EMS、MNNG和DMS。
图7
图7
PolíK550R和K550Q变体的特征。(一)K550R取代对MMS诱导的PolⅠ乙酰化的影响。使用抗乙酰化赖氨酸单克隆抗体进行Western blot。使用抗PolⅠC末端片段的多克隆兔抗体观察PolⅠ。(b条)比较Polι定位到野生型GFP Polι、GFP Polι-K550R和GFP Polι-K550Q的“复制工厂”中，分别阻断或模拟K550残基的乙酰化。将相应质粒转染MRC5细胞。显示有病灶的细胞核百分比的直方图（左图）。数字基于3个重复，其中GFP阳性细胞的每个细胞系都有200个细胞核。GFP阳性细胞示例，细胞核无病灶（右上面板）或有病灶（右下面板）。
图8
图8
Polí乙酰化的表征。(一)p300敲除对1 h，使用200μM MMS或DMS。(b条)p300/CBP抑制剂L002对MMS诱导的Polí乙酰化的影响。(c（c）)对联合转染FLAG-PolⅠ和野生型mCBP，或具有消除CBP乙酰转移酶活性的L1435A/D1436A（LD）突变的HEK293T细胞提取物进行免疫沉淀分析。(d日)1的效果 在p300和CBP的细胞水平上，用200μM MMS或DMS处理h。(电子)CBP敲除对处理1小时的细胞中Polι乙酰化的影响 h，使用200μM MMS或DMS。(（f）)p300过度生产、MMS或DMS处理对Polí或Polη乙酰化的影响。从转染FLAG-Polí（左面板）或FLAG-Pol-η（右面板）的HEK293T细胞提取物中免疫沉淀FLAG-标记聚合酶。如图所示，细胞与野生型p300-c-myc联合转染，并处理1 200小时 mM DMS或MMS。除非另有说明，HEK293T细胞瞬时转染FLAG-PolⅠ质粒。转染后24小时用DKAc抑制剂混合物处理细胞24小时。使用以下抗体通过western blot观察蛋白质；抗p300多克隆抗体（p300蛋白）；抗乙酰化赖氨酸单克隆抗体（乙酰化PolⅠ）；抗PolⅠC末端片段的多克隆兔抗体；或针对FLAG表位的单克隆抗体，如图所示。
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