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.2019年5月;11(5):e9561。
doi:10.15252/emmm.201809561。

蛋白酶体抑制可拯救呼吸链组装因子COA7的致病性变体

附属公司

蛋白酶体抑制可拯救呼吸链组装因子COA7的致病性变体

卡西克·莫汉拉吉(Karthik Mohanraj)等。 EMBO分子医学. 2019年5月.

摘要

核和线粒体基因组突变导致各种线粒体疾病,其中许多影响线粒体呼吸链。线粒体膜间隙(IMS)的蛋白质组由几个重要的组装因子组成,参与线粒体呼吸链复合体的生物发生。本研究综合分析了最近发现的IMS蛋白细胞色素c(c)氧化酶组装因子7(COA7)或呼吸链组装因子1(RESA1),与罕见形式的线粒体白质脑病和复合IV缺乏症相关。我们发现,COA7需要线粒体IMS导入和组装(MIA)途径才能在IMS中有效积累。我们还发现,COA7的致病突变版本的导入速度比野生型蛋白慢,并且定位错误的蛋白在胞质溶胶中被蛋白酶体降解。有趣的是,蛋白酶体抑制既挽救了COA7的线粒体定位,又挽救了患者源性成纤维细胞的复合物IV活性。我们提出蛋白酶体抑制作为一种新的治疗方法,用于治疗与线粒体蛋白水平降低相关的广泛线粒体疾病。

关键词:COA7/RESA1;线粒体疾病;蛋白酶体;蛋白质降解;蛋白质输入。

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利益冲突声明

提交人声明他们没有利益冲突。

数字

图1
图1。COA公司7与米娅40通过二硫键
  1. A类

    蛋白质丰度是蛋白质的标准化信号强度(LFQ)除以其分子量。特异性(富集)是MIA40中蛋白质LFQ强度的比率旗帜控制样品的分数。出于计算目的,将对照样品中未检测到的蛋白质的LFQ任意设置为1。LFQ,无标签量化;M.W.,分子量。

  2. B类

    诱导Flp-In T‐REx 293细胞表达MIA40旗帜MIA40的亲和纯化旗帜已执行。通过SDS-PAGE和Western blot分析组分。负荷:2.5%。洗脱液:100%。未绑定:2.5%。

  3. C类

    诱导Flp-In T‐REx 293细胞表达MIA40旗帜MIA40的亲和纯化旗帜执行。洗脱液组分在还原(DTT)或非还原(IAA)条件下溶解,并通过SDS-PAGE和Western blot进行分析。DTT,二硫苏糖醇;IAA,碘乙酰胺。洗脱液:100%。

  4. D类

    诱导野生型或突变型MIA40表达的Flp-In T‐REx 293细胞的细胞蛋白提取物旗帜进行亲和纯化。通过还原SDS-PAGE和Western blot分析负荷和洗脱液组分。负荷:2.5%。洗脱:100%。

可在线获取此图的源数据。
图EV1
图EV1。COA公司7与米娅40通过二硫键
  1. A类

    诱导Flp-In T‐REx 293细胞表达MIA40旗帜MIA40的亲和纯化旗帜已执行。用SDS-PAGE和Western blot分析各组分。负荷:2.5%。洗脱液:100%。

  2. B类

    诱导Flp-In T‐REx 293细胞表达ALR旗帜并对ALR进行亲和纯化旗帜已执行。用SDS-PAGE和Western blot分析各组分。负荷:2.5%。洗脱液:100%。

  3. C类

    从诱导表达野生型和突变型MIA40的Flp-In T‐REx 293细胞中分离出线粒体旗帜在非还原条件下。通过非还原性SDS-PAGE和Western blot分析提取物。

  4. D类

    从诱导表达野生型和突变型MIA40的Flp-In T‐REx 293细胞中分离出细胞蛋白提取物旗帜在非还原条件下。通过非还原性SDS-PAGE和Western blot分析提取物。

图2
图2。COA公司7是人体线粒体膜间隙中的一种氧化蛋白
  1. A类

    巯基捕获分析的示意图。用二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)或4-乙酰氨基-4-马来酰二苯乙烯-2,2-二磺酸(AMS)将线粒体溶解在样品缓冲液中。样品通过SDS-PAGE和Western blot进行分析。

  2. B类

    间接硫醇捕获试验。如图所示,用IAA预处理线粒体以阻断游离半胱氨酸残基,随后用DTT还原二硫键。用AMS将线粒体溶解在样品缓冲液中。

  3. C类

    通过蛋白酶K在完整线粒体(250 mM蔗糖)、有丝分裂体(5 mM蔗糖。样品通过SDS-PAGE和Western blot进行分析。线粒体;Sup,线粒体后上清液;OM,外膜;IM,内膜;IMS,膜间空间。

  4. D类

    N‐SIM超分辨率显微照片Z轴堆叠(0.15μm)正交截面(XYZ(XYZ))HeLa细胞或稳定表达COA7‐HA的HeLa电池,转染不同标记物TOMM20‐DsRed(OM)、COX8A‐Ds Red(IM)和标记有抗-HA、抗-COA7和Smac/Diablo(IMS)抗体的基质靶向光活化GFP(基质靶向)。这张图片代表了来自三个独立实验的大多数细胞群体。比例尺=2μm,放大插件中的比例尺=0.5μm。该面板显示了与抗-HA或抗-CAO7的不同小班组合的共同定位体积中的皮尔逊系数。数据表示为平均值±SD(n个 = 5). ***P(P)<0.001[IMSxEnd与IMxEndP(P) = 0.0001; IMSxEnd与MxEndP(P) = 0.0002], ****P(P)<0.0001[OMxHA与IMSxHAP(P) < 0.0001; IMSxHA与IMxHAP(P)<0.0001](单向方差分析)。M、 矩阵;末端,内源性COA7;HA、COA7-HA。

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图3
图3。COA公司7不影响米娅通路
  1. A类

    从转染了编码COA7的质粒的细胞中分离出线粒体高速钢或空向量。通过SDS-PAGE和Western blot对线粒体进行溶解和分析。线粒体。

  2. B类

    无线电标签[35S] TIMM8A和[35S] COX19前体被导入线粒体,线粒体是从细胞中分离出来的,这些细胞转染了编码COA7的质粒高速钢或空向量。通过还原SDS-PAGE和放射自显影术对样品进行分析。对三个生物复制的结果进行分析、量化并标准化,以在30分钟内控制线粒体。数据表示为平均值±SEM(n个 = 3). IAA,碘乙酰胺。

  3. C类

    从转染了编码COA7的质粒的细胞中分离出线粒体高速钢或在还原(DTT)和非还原(IAA)条件下的空载体,并通过Western blot分析MIA40水平。

  4. D类

    空质粒或COA7转染HEK293细胞的蛋白质高速钢用PEG‐PCMal进行改性。对照细胞用硫醇氧化剂二胺(DAM)或还原剂DTT预处理。通过SDS–PAGE和蛋白质印迹对样品进行分析。

  5. E类

    诱导Flp-In T‐REx 293细胞表达MIA40旗帜用编码COA7的质粒转染高速钢或空向量。MIA40的亲和纯化旗帜用SDS-PAGE和Western blot分析洗脱液组分。

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图EV2
图EV2。COA公司7不影响米娅40‐ALR公司相互作用
  1. A类

    从诱导表达MIA40的Flp-In T‐REx 293细胞中分离出蛋白质提取物旗帜其用靶向COA7 mRNA的寡核苷酸或对照寡核苷酸转染并进行亲和纯化。样品通过SDS-PAGE和Western blot进行分析。负荷:2.5%。洗脱液:100%。

  2. B类

    从HeLa细胞中分离出细胞蛋白提取物,这些细胞转染了靶向COA7 mRNA不同区域或对照寡核苷酸的寡核苷酸。通过还原SDS-PAGE和Western blot对样品进行分析。

  3. C类

    从诱导表达ALR的Flp-In T‐REx 293细胞中分离出蛋白质提取物旗帜用靶向COA7 mRNA或控制寡核苷酸的寡核苷酸转染,并进行亲和纯化。样品通过SDS-PAGE和Western blot进行分析。负载:2.5%。洗脱液:100%。

  4. D类

    诱导Flp-In T‐REx 293细胞表达ALR旗帜用编码COA7的质粒转染高速钢或空向量。ALR的亲和纯化旗帜对样品进行SDS-PAGE和Western blot分析。

图4
图4。米娅40个便利COA公司7导入线粒体
  1. A、 B类

    无线电标签[35S] COA7(A)和[35S] 将TIMM8A(B)前体导入从诱导表达MIA40的Flp-In T‐REx 293细胞分离的线粒体旗帜.通过还原SDS-PAGE和放射自显影术对样品进行分析。对三个生物复制的结果进行分析、量化并标准化,以在45分钟时控制线粒体。数据表示为平均值±SEM(n个 = 3). IAA,碘乙酰胺。

  2. C类

    从诱导表达MIA40的Flp-In T‐REx 293细胞中分离出线粒体旗帜和控制细胞。样品通过SDS-PAGE和Western blot进行分析。线粒体。

  3. D、 E类

    无线电标签[35S] COA7(D)和[35S] TIMM8A(E)前体被导入从Flp‐In T‐REx 293细胞中分离出来的线粒体中,这些细胞被诱导表达ALR旗帜和控制细胞。通过还原SDS-PAGE和放射自显影术对样品进行分析。对三个生物实验的结果进行了分析、量化和标准化,以在45分钟时控制线粒体。数据表示为平均值±SEM(n个 = 3).

  4. F类

    从诱导表达ALR的Flp-In T‐REx 293细胞中分离出线粒体旗帜和控制细胞。样品通过SDS-PAGE和Western blot进行分析。

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图5
图5。米娅40人参与了COA公司7
  1. A类

    从转染了靶向MIA40 mRNA不同区域的寡核苷酸或对照寡核苷酸的HeLa细胞中分离出细胞蛋白提取物。通过还原SDS-PAGE和Western blot对样品进行分析。

  2. B类

    从转染了靶向ALR mRNA不同区域的寡核苷酸或对照寡核苷酸的HeLa细胞中分离出细胞蛋白提取物。通过还原SDS-PAGE和Western blot对样品进行分析。

  3. C类

    包含HEK293 MIA40 WT/WT和HEK299 MIA40 TT/Del中CPC基序的MIA40序列示意图53‐60细胞。

  4. D类

    从HEK293 MIA40 WT/WT和WT/Del中分离出细胞蛋白提取物53‐60细胞。通过SDS–PAGE和蛋白质印迹对样品进行分析。

  5. E类

    从HEK293 MIA40 WT/WT和WT/Del中分离出细胞蛋白提取物53‐60用编码MIA40或空载体的质粒转染的细胞。对样品进行还原SDS-PAGE和Western blot。

  6. F、 G公司

    无线电标签[35S] COA7(F)和[35S] 将TIMM8A(G)前体导入从HEK293 MIA40 WT/WT和WT/Del分离的线粒体53‐60细胞。通过还原SDS-PAGE和放射自显影术对样品进行分析。对三个生物复制的结果进行分析、量化并标准化,以在45分钟时控制线粒体。数据表示为平均值±SEM(n个 = 3). IAA,碘乙酰胺。

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图6
图6。COA公司7种病理变异为进口缺陷
  1. A类

    野生型和突变型COA7的示意图。

  2. B类

    从HEK293细胞中分离出细胞蛋白提取物,这些细胞转染了编码野生型或突变COA7的质粒。通过还原SDS-PAGE和Western blot对样品进行分析。

  3. C类

    用编码野生型或突变COA7的质粒转染HEK293细胞制备细胞组分。通过还原SDS-PAGE和Western blot分析组分。T、 总量;C、 胞浆;M、 线粒体。

  4. D类

    瞬时表达野生型或突变型COA7的HEK293细胞高速钢COA7的亲和纯化高速钢已执行。通过还原性和非还原性SDS-PAGE和Western blot分析样品。负荷:3%。洗脱液:100%。

  5. E类

    同等数量的野生型和突变型放射性标记[35S] COA7前体导入HEK293细胞分离的线粒体。通过还原SDS-PAGE和放射自显影术对样品进行分析。分析、量化三个生物重复的结果,并在45分钟时将其归一化为野生型COA7。数据表示为平均值±SEM(n个=3)。IAA,碘乙酰胺。

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图7
图7。蛋白酶体降解细胞溶质COA公司7种变体
  1. A类

    蛋白质稳定性分析示意图。

  2. B类

    瞬时表达野生型或突变COA7的HEK293细胞高速钢用CHX处理指定时间,并分离蛋白质提取物。通过还原SDS-PAGE和Western blot对样品进行分析。

  3. C类

    翻译和蛋白酶体抑制联合检测的示意图。

  4. D类

    瞬时表达野生型或突变COA7的HEK293细胞高速钢用CHX和/或MG132处理指定时间,并分离蛋白质提取物。通过还原SDS-PAGE和Western blot对样品进行分析。CHX、环己酰亚胺。

  5. E类

    细胞定位分析的示意图。

  6. F类

    从瞬时表达突变COA7的HEK293细胞制备细胞组分高速钢并用MG132治疗。通过还原SDS-PAGE和Western blot对样品进行分析。

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图EV3
图EV3。泛素-蛋白酶体系统的参与YME公司1L用于降解COA公司7及其突变体
  1. A类

    从表达泛素的HEK293细胞中分离出细胞蛋白提取物高速钢(优步伊斯)和COA7旗帜并进行亲和纯化。负荷:2.5%。洗脱液:100%。

  2. B类

    48和72小时后,从患者成纤维细胞中分离出细胞蛋白提取物,这些成纤维细胞转染了靶向YME1L mRNA不同区域的寡核苷酸或对照寡核苷酸。通过还原SDS-PAGE和Western blot对样品进行分析。

图8
图8。蛋白酶体的抑制可拯救线粒体水平的COA公司7来自患者的成纤维细胞
  1. A类

    从永生化患者皮肤成纤维细胞中分离出细胞蛋白提取物,这些成纤维细胞经指定浓度的MG132、硼替佐米或卡非佐米处理。通过还原SDS-PAGE和Western blot对样品进行分析。

  2. B类

    细胞组分由永生化患者衍生皮肤成纤维细胞制备,这些成纤维细胞经指定浓度的MG132、硼替佐米或卡非佐米处理。通过还原SDS-PAGE和Western blot对样品进行分析。T、 总量;C、 胞浆;M、 线粒体。

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图9
图9。蛋白酶体的抑制可挽救呼吸复合物的活性和组装
  1. A类

    通过细胞色素氧化评估复合物IV的活性c(c)永生化患者皮肤成纤维细胞的数字化细胞提取物和健康成纤维细胞对照。对三个生物复制的结果进行量化和标准化,以控制成纤维细胞。数据表示为平均值±SEM(n个=3*P(P)=0.01)(双尾学生t吨‐测试)。

  2. B类

    通过细胞色素氧化评估复合物IV的活性c(c)用MG132(1μM)、硼替佐米(20 nM)或卡非佐米(50 nM)处理12 h,然后再恢复6 h的永生化患者皮肤成纤维细胞的数字细胞提取物。三个生物重复的结果被量化并归一化为DMSO处理的样品,数据表示为平均值±SEM(n个 = 3, *P(P)=0.04[DMSO vs MG132]**P(P)=0.0025[DMSO与硼替佐米]*P(P)=0.02[DMSO vs Carfilzomib])(双尾学生t吨‐测试)。

  3. C类

    永久性患者衍生皮肤成纤维细胞瞬时表达野生型或突变型COA7(COA7-Y137C和COA7-Ex2)在最后12小时内用硼替佐米(20nM)处理48小时。采集成纤维细胞,并在数字化细胞提取物中测量复合IV活性。对三个生物重复的结果进行量化,并将其归一化为空白载体硼替佐米处理样品,数据表示为平均值±SEM(n个 = 3, *P(P)=0.01[空载矢量vs.COA7-Wt]*P(P)=0.005[空向量vs COA7–Y137C])(双尾学生t吨‐测试)。

  4. D类

    将从对照组和患者成纤维细胞分离的线粒体溶解在洋地黄缓冲液中,并通过4–13%凝胶BN‐PAGE和Western blot进行分析。SC,超级复合体。

  5. E类

    用编码野生型COA7的质粒转染永生患者皮肤成纤维细胞高速钢或COA7‐Y137C高速钢在DDM缓冲液中溶解,并通过4–13%凝胶BN‐PAGE和Western blot进行分析。

  6. F类

    从用硼替佐米(10 nM)处理12 h的永生化患者皮肤成纤维细胞中分离出线粒体,然后再恢复6 h。线粒体在洋地黄素缓冲液中溶解,并通过4–13%凝胶BN‐PAGE和Western blot进行分析。SC,超级复合体。

图10
图10。的作用米娅生物发生中的途径和蛋白酶体COA公司7
  1. A类

    野生型COA7的前体形式在胞浆中合成,并通过MIA途径导入线粒体膜间空间,参与呼吸链的生物发生。

  2. B类

    突变体COA7的前体形式具有导入缺陷,因此,它在胞浆中被蛋白酶体降解。

  3. C类

    蛋白酶体抑制挽救了突变COA7的线粒体输入以及呼吸链的生物发生和功能。

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