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.2019年5月10日；294（19）：7692-7710。
doi:10.1074/jbc。RA119.007640。 Epub 2019年3月18日。

蛋白精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）通过激活WNT/β-catenin和AKT/GSK3β增殖信号促进淋巴瘤细胞存活

钟吉云 1, 弗拉杰什·卡克哈尼斯 1, 罗伯特·A·拜奥基 1, 萨伊德·西夫 2
附属公司

蛋白精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）通过激活WNT/β-catenin和AKT/GSK3β增殖信号促进淋巴瘤细胞存活

Jihyun Chung先生等。 生物化学杂志. .

摘要

II型蛋白精氨酸甲基转移酶PRMT5的表观遗传调控在控制癌细胞增殖和肿瘤发生中起着重要作用。在本报告中，我们研究了三种不同类型的非霍奇金淋巴瘤细胞系、临床样本和小鼠原发性淋巴瘤细胞中PRMT5和WNT/β-CATENIN以及AKT/GSK3β增殖信号的关系。我们表明，PRMT5通过直接表观遗传沉默途径拮抗剂刺激WNT/β-CATENIN信号传导，AXIN2型和无线网络1和AKT/GSK3β信号的间接激活。shRNA-介导的敲除或特定小分子PRMT5抑制剂CMP-5对PRMT5的抑制不仅导致WNT拮抗剂的去抑制，活性磷酸化AKT（Thr-450和Ser-473）和非活性磷酸化GSK3β（Ser-9）的水平降低，而且还导致WNT/β-CATENIN靶基因的转录降低，循环蛋白D1，c-MYC、，和苏维文，淋巴瘤细胞死亡加重。此外，PRMT5抑制导致联合激活物CBP、p300和MLL1的招募减少，以及联合阻遏物HDAC2和LSD1向WNT/β-CATENIN靶基因启动子的招募增加。这些结果表明，PRMT5通过促进WNT/β-CATENIN和AKT/GSK3β增殖信号传导来控制促生存基因的表达，其抑制作用诱导淋巴瘤细胞死亡，这值得进一步的临床评估。

关键词：Akt PKB；WNT拮抗剂；WNT/β-catenin信号；Wnt信号；组蛋白；淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤；蛋白精氨酸N-甲基转移酶5（PRMT5）；蛋白精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）；蛋白激酶B（AKT）/糖原合成酶激酶3β。

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数字

图1。
图1。
PRMT5调节患者衍生淋巴瘤细胞系中的WNT/β-CATENIN信号。 A中，的级别PRMT5项目, β-卡特宁,细胞周期蛋白D1，c-MYC公司、和苏维文使用基因特异性引物和探针集，通过实时RT-PCR在正常B细胞（静止或激活）、GCB前MCL（Mino和JeKo）、GCB-DLBCL（Pfeiffer和Toledo）和GCB后ABC-DLBCL细胞（SUDHL-2和OCI-Ly3）中检测mRNA。这些值表示三个生物复制品的平均值，每个生物复制品有三个技术复制品，并以平均值±S.D.的形式报告。18秒rRNA被用作内部对照。B、，使用所示抗体通过Western blotting分析来自正常或转化B细胞的RIPA提取物（20μg）。β-肌动蛋白用作负荷控制，用于B类和图2D类因为这些数据来自同一个实验。该实验重复了两次，并显示了具有代表性的斑点。C、，约25μg核(N个)或细胞溶质(C类)从正常休眠或激活的B细胞以及指示的淋巴瘤细胞系中制备提取物，并使用指示的抗体检测蛋白质。BRG1和α-管蛋白都可以作为核和细胞溶质分馏的对照。D、，的级别PRMT5项目, β-卡特宁,细胞周期蛋白D1，c-MYC公司、和苏维文mRNA通过实时RT-PCR检测，使用从未感染的任何一种中分离的总RNA(Ctrl键)JeKo、Pfeiffer和SUDHL-2细胞，或感染shGFP或shPRMT5慢病毒的淋巴瘤细胞。使用特定的引物和探针组检测每个指示的基因。本实验使用三个生物复制品和三个技术复制品进行，如A类.**表示对值<10−3.E、，从对照感染和感染（shGFP或shPRMT5）淋巴瘤细胞系中制备RIPA提取物（20μg），并使用指示的抗体进行免疫印迹分析。β-肌动蛋白用作负荷控制。
图2。
图2。
PRMT5表观遗传调节AXIN2型和WIF1系列，并且其抑制作用使两个靶基因重新激活。 A中，使用抗H3（Me）抗体免疫沉淀Pfeiffer细胞的交联染色质2)R8抗体，并由ChIP-Seq按照“实验程序”进行分析。H3（Me）的富集2)R8开启AXIN1型,AXIN2型、和WIF1系列使用两个生物复制品（H3（Me2)R8-1和H3（Me2)R8-2）。H3（Me的峰值检测2)报告R8富集蓝色与控制输入相比，后者在灰色。B、，使用预免疫对Pfeiffer细胞的交联染色质进行ChIP分析(圆周率)、抗PRMT5、抗H3（Me2)R8或抗H4（Me2)R3抗体。ChIP实验使用两个生物重复和三个技术重复进行AXIN1型,AXIN2型、和WIF1系列实时PCR检测启动子序列。相对于PI样品计算每个抗体的折叠富集。每个中的数据图表表示平均值±S.D。C、，的级别AXIN1型,AXIN2型、和WIF1系列使用基因特异性引物和探针集，通过实时RT-PCR在正常B细胞（静止和激活）和指示的转化B细胞中测量mRNA。本实验采用三个生物重复和三个技术重复进行18秒rRNA作为对照。所示数据代表平均值±S.D。D、，使用所示抗体通过Western blotting分析正常（静止和激活）和转化B细胞的RIPA提取物（20μg）。抗β-肌动蛋白用于显示等负荷。β-肌动蛋白负荷控制B类和D类是相同的，因为这些数据来自同一个实验。E、，的级别PRMT5项目,轴1,AXIN2型、和WIF1系列用两个对照组的总RNA测量mRNA(Ctrl键)未感染的JeKo、Pfeiffer和SUDHL-2细胞或感染shGFP或shPRMT5慢病毒的淋巴瘤细胞C类.**表示对值<10−3.F、，使用从感染后72 h的对照未感染和感染（shGFP或shPRMT5）JeKo、Pfeiffer和SUDHL-2淋巴瘤细胞系制备的RIPA提取物（20μg），通过Western blotting分析AXIN1、AXIN2和WIF1蛋白水平。抗β-肌动蛋白用于显示等负荷。G、，使用来自对照shGFP-或shPRMT5感染的淋巴瘤细胞系的交联染色质进行ChIP测定。使用指示的抗体测定PRMT5及其诱导的表观遗传标记的富集，并使用PI抗体作为对照。使用三个生物复制品和三个技术复制品重复此实验，数据绘制如下B类.
图3。
图3。
AXIN2和/或WIF1的再表达通过AKT失活抑制WNT/β-CATENIN靶基因的表达。 A中，用任一对照转染Pfeiffer细胞(Ctrl键)载体（pCMV-entry）或pCMV-entry/AXIN2和/或pCMV entry/WIF1 72小时，以及AXIN2型,无线网络1,循环蛋白D1，c-MYC公司、和苏维文通过实时RT-PCR进行分析。本实验使用三个生物重复，每个重复三个技术重复，以及β-肌动蛋白用作对照。所示数据代表平均值±S.D.，**表示对值<10−3.B、，用所示抗体通过免疫印迹分析从对照未感染或转染Pfeiffer细胞制备的RIPA提取物（20μg）。检测到β-肌动蛋白显示等负荷。C、，使用RIPA提取物（20μg）通过免疫印迹法测定活性磷酸化AKT（Thr-450或Ser-473）和非活性AKT以及活性GSK3β或非活性磷酸化GSK3？（Ser-9）的水平由感染慢病毒的Pfeiffer细胞制备，慢病毒表达对照shGFP或shPRMT5，以及用对照DMSO或CMP-5处理的Pfeeffer细胞。未感染和CMP-6处理的Pfeiffer细胞均被用作内部对照。在感染后72小时或治疗后48小时制备RIPA细胞提取物。D、，用控制二甲基亚砜或增加AKT抑制剂IV浓度（0.2和2μ米)和mRNA水平循环蛋白D1，c-MYC公司、和生存素使用基因特异性引物和探针集通过实时RT-PCR进行评估，如A.E、，Pfeiffer细胞按D类和RIPA提取物（20μg）使用所示抗体通过Western blotting进行分析。检测到β-肌动蛋白显示等负荷。
图4。
图4。
PRMT5敲除通过AXIN2和WIF1的重新表达以及AKT信号的失活触发WNT/β-CATENIN靶基因抑制。Pfeiffer细胞被表达shPRMT5的慢病毒感染PRMT5、AKT、AXIN2、，和WIF1系列(A类)、和PRMT5，循环D1，c-MYC公司、和苏维文(B类)通过实时RT-PCR在不同时间点使用18秒rRNA作为内部控制。为了进行比较，在感染前0 h测定mRNA水平。数值表示三个生物复制品的平均值，每个生物复制品有三个技术复制品，报告为平均值±S.D。C、，从对照未感染（0小时）和感染（shPRMT5）的Pfeiffer细胞系中制备RIPA提取物（20μg），并使用指示的抗体通过免疫印迹进行分析。检测到β-肌动蛋白显示等负荷。
图5。
图5。
β-CATENIN募集到循环蛋白D1，c-MYC公司、和苏维文在淋巴瘤细胞中增加，并且不受PRMT5敲除的影响。 A中，使用来自正常或指示转化的B细胞的交联染色质，使用PI或免疫抗β-CATENIN抗体进行ChIP分析。本实验使用三个生物复制品进行，每个生物复制品有三个技术复制品循环蛋白D1，c-MYC公司、和苏维文实时PCR检测启动子序列。相对于PI样品计算折叠富集度，每个样品中的数据图表表示为平均值±S.D。B、，使用PI或免疫抗β-CATENIN抗体免疫沉淀来自感染慢病毒的指示淋巴瘤细胞的交联染色质，慢病毒表达控制性shGFP或shPRMT5。每个中的值图表使用两个生物复制品生成，每个复制品有三个技术复制品，如交流，用二甲基亚砜或CMP-5处理JeKo、Pfeiffer和SUDHL-2细胞，用PI或免疫抗β-CATENIN抗体免疫沉淀交联染色质。循环蛋白D1，c-MYC公司、和苏维文启动子序列检测如B类.
图6。
图6。
PRMT5基因敲除改变WNT/β-CATENIN靶基因的共激活物和共阻遏物的募集。 A类和B、，使用所示抗体对感染慢病毒的Pfeiffer细胞的交联染色质进行免疫沉淀，慢病毒表达对照shGFP或shPRMT5，PI抗体用作对照。使用两个生物复制品和三个技术复制品进行ChIP分析。计算每个抗体相对于PI样品的折叠富集度，以及每个抗体中的数据图表表示为平均值±S.D。
图7。
图7。
PRMT5过度表达与NHL临床样本中WNT/β-CATENIN和AKT/GSK3β信号增强相关。水平PRMT5项目, β-卡特宁,AXIN2型,WIF1系列,葛兰素史克3β (A类)和循环蛋白D1，c-MYC公司、和苏维文(B类)在正常B细胞和NHL患者样本中检测mRNA(2, 9,和16)使用基因特异性引物和探针组进行实时RT-PCR。本实验使用三个生物重复，每个重复三个技术重复，数值代表平均值±S.D。18秒rRNA被用作内部对照。C、，从正常B细胞和NHL患者样本中制备的RIPA提取物（40μg）用所示抗体进行免疫印迹分析，并检测β-肌动蛋白以显示等负荷。
图8。
图8。
PRMT5敲除或抑制导致轴2和无线1小鼠原发性淋巴瘤细胞中WNT/β-CATENIN和AKT/GSK3β信号的去表达和失活。 A中，对正常小鼠B细胞和Eμ-BRD2细胞的总RNA进行实时RT-PCR，并使用基因特异性引物集和探针测量指示靶基因的稳态mRNA水平。B、，在感染表达控制shGFP–GFP或shPRMT5–GFP的慢病毒之前，通过添加重组人白细胞介素-4（15 ng/ml）和山羊抗人IgG+IgM（15μg/ml）激活Eμ-BRD2细胞。感染后72小时分离总RNA，并使用基因特异性引物和探针集通过实时RT-PCR测量指示基因的mRNA水平。C、，从用对照DMSO或CMP-5处理的Eμ-BRD2细胞中分离总RNA，并在处理后48小时测量所示靶基因的mRNA水平，如出生日期：，从所示细胞中制备RIPA提取物（40μg），并使用指定抗体进行免疫印迹分析。β-肌动蛋白用作负荷控制。E类和F、，ChIP分析使用来自感染表达shGFP或shPRMT5慢病毒的活化Eμ-BRD2细胞的交联染色质进行。每个中的值图表由两个生物重复和三个技术重复生成，并绘制为平均值±S.D。
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