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.2019年4月；8(4):1721-1730.
doi:10.1002/cam4.2040。 Epub 2019年3月18日。

干扰长非编码RNA CDKN2B-AS1上调miR-181a-5p/TGFβI轴抑制宫颈癌细胞转移、促进凋亡和衰老

朱丽红 1, 张全华 1, 李少平 1, 山江 1, 崔晶晶 1, 葛当 2
附属公司

干扰长非编码RNA CDKN2B-AS1上调miR-181a-5p/TGFβI轴抑制宫颈癌细胞转移、促进凋亡和衰老

朱丽红等。 癌症医学. 2019年4月.

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    [未列出作者] [未列出作者] 癌症医学，2023年12月18日；13（1）：e6713。doi:10.1002/cam4.6713。打印前在线。 《癌症医学》，2023年。 PMID：38108614 免费PMC文章。

摘要

长非编码RNA（lncRNA）CDKN2B-AS1已被证明在包括宫颈癌在内的各种人类癌症的发展和预后中起着关键作用。然而，CDKN2B-AS1与宫颈癌之间的潜在机制有待进一步探讨。在本研究中，RT-PCR显示，宫颈癌细胞系中CDKN2B-AS1的mRNA水平显著上调，而miR-181a-5p下调。此外，shRNA对CDKN2B-AS1的干扰导致了细胞增殖、侵袭、迁移的抑制以及凋亡和衰老的促进，CDKN2B-AS1过表达或miR-181a-5p均显示相反的结果。进一步研究表明，CDKN2B-AS1可与miR-181a-5p直接相互作用，且miR-181a-5p与CDKN2B-AS1呈负相关。此外，我们发现TGFβI是miR-181a-5p的靶点，可以通过CDKN2B-AS1敲除下调。此外，体内实验进一步证明了CDKN2B-AS1在宫颈癌中的作用，包括肿瘤生长、凋亡抑制和衰老抑制，CDKN2B-AS1基因敲除可抑制上述活性。总之，我们的研究表明CDKN2B-AS1/miR-181a-5p/TGFβI轴可能在宫颈癌的发展中起着重要作用。

关键词：CDKN2B-AS1；宫颈癌；上皮-间充质转化；衰老。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
宫颈癌细胞系中CDKN2B‐AS1上调，miR‐181a‐5p下调。（A） 通过qRT‐PCR检测CDKN2B‐AS1在人类宫颈正常细胞系Etc1/E6E7和HPV‐18感染的宫颈癌细胞HeLa，C4‐1以及HPV‐）16感染的宫颈肿瘤细胞SiHa，Ca Ski中的表达。内部控制采用GAPDH。*P（P）<0.05时，**对<0.01，***P（P）<0.001，与Etc1/E6E7组相比。（B） 通过qRT-PCR检测miR‐181a‐5p在人类正常宫颈细胞系Etc1/E6E7和宫颈癌细胞系HeLa、C4-1、SiHa和Ca-Ski细胞中的表达。U6被用作内部控制。*P（P） < 0.05，**P < 0.01，***P与Etc1/E6E7组相比<0.001
图2
图2
CDKN2B‐AS1可以直接与HeLa细胞中的miR‐181a‐5p相互作用。（A） 预测CDKN2B‐AS1和miR‐181a‐5p之间的结合位点。（B） 通过qRT‐PCR检测sh-CDKN2B‐AS1转染或不转染miR‐181a抑制剂后，HeLa细胞中miR-181a‐5p mRNA水平的表达。U6被用作内部控制。**P<0.01与对照组比较##P<0.01与miR‐181a抑制剂组相比。（C） CDKN2B‐AS1构建于腺病毒包装载体（Ad‐CDKN2 B‐AS 1）上。通过qRT‐PCR检测Ad‐CDKN2B‐AS1转染或不转染miR‐181a模拟物后，HeLa细胞中miR-181a‐5p mRNA水平的表达。U6被用作内部控制。**P<0.01与对照组比较##P<0.01与miR‐181a模拟组相比。（D） 荧光素酶报告子法检测荧光素素酶活性。使用Lipofectamine 2000与50 nM miR‐181a‐5p模拟物或NC寡核苷酸以及200 ng pmirGLO‐CDK‐wt或pmirGLO-CDK­mut共同转染HEK 293 T细胞。在转染24小时后测量萤火虫荧光素酶的相对活性，并用肾小球荧光素酶活性进行标准化&& P<0.01与CDK‐wt组相比。所示数据是三个单独实验的平均值±标准误差。CDK=CDKN2B-AS1
图3
图3
CDKN2B‐AS1通过抑制miR‐181a‐5p促进HeLa细胞的侵袭和迁移。细胞分为四组：Ctrl、sh‐CDKN2B‐AS1、miR‐181a抑制剂和sh‐CDM+抑制剂。（A） Boyden Chamber Transwell法检测HeLa细胞的侵袭能力。量化细胞侵袭能力。来自至少10个字段和数据的平均细胞计数表示三个单独实验中三次测定的平均值±SD，并使用未配对的t吨测试。（B） 通过伤口愈合实验检测HeLa细胞的迁移能力。用移液管尖端刮取HeLa细胞培养24小时。提出了一种具有代表性的伤口愈合试验。**对与Ctrl组相比，<0.01。## 对与miR‐181a抑制剂组相比，<0.01
图4
图4
CDKN2B‐AS1敲除抑制HeLa细胞的EMT。通过western blot检测在含有或不含miR‐181a抑制剂的sh-CDKN2B-AS1转染HeLa细胞后，E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和蜗牛的相对蛋白表达。GAPDH被用作内部控制。**P（P）与对照组比较<0.01##对与miR‐181a抑制剂组相比，<0.01
图5
图5
CDKN2B‐AS1敲除抑制HeLa细胞的增殖并促进其凋亡和衰老。细胞分为四组：Ctrl、sh‐CDKN2B‐AS1、miR‐181a抑制剂和sh‐CDM+抑制剂。（A） 对Hoechst染色和细胞凋亡率进行量化。（C） Ki67和裂解Caspase‐3的蛋白表达，GAPDH起到了内部控制作用。通过ImageJ软件对信号强度进行定量。（D） 衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测衰老
图6
图6
miR‐181a‐5p通过靶向TGFβI调节EMT、凋亡和衰老。（B） 通过qRT-PCR检测TGFβI在人正常宫颈细胞系Etc1/E6E7和宫颈癌细胞系HeLa、C4-1、SiHa和Ca-Ski细胞中的表达。内部控制采用GAPDH。*对 < 0.05,**对 < 0.01,***P（P）与Etc1/E6E7组相比<0.001。（C） 引入SB431542来抑制TGFβI。用Ad-CDKN2B-AS1转染HeLa细胞，无论是否加入SB431542。通过蛋白质印迹检测HeLa细胞中TGFβI、VEGFA和波形蛋白的相对蛋白水平。GAPDH被用作内部控制。（D） 量化细胞侵袭能力。（E） 细胞凋亡率被量化。（F） 衰老通过衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测。**P<0.01，与Ctrl组相比##P<0.01与SB431542组相比。
图7
图7
CDKN2B‐AS1基因敲除抑制体内HeLa异种移植瘤的存活。（A） sh‐CDKN2B‐AS1降低肿瘤重量**对与对照组相比<0.01。（B） 在HeLa（有或无sh‐CDKN2B‐AS1转染）异种移植瘤中CDKN2B-AS1和miR‐181a‐5p的相对表达。（C） western blot检测HeLa（有或无sh‐CDKN2B‐AS1转染）异种移植瘤中TGFβI、VEGFA和Vimentin的相对蛋白水平。GAPDH被用作内部控制。（D） 免疫组织化学检测caspase‐3和Ki67的蛋白表达。计数阳性细胞。所示数据是三个单独实验的平均值±标准误差***对<0.001，与对照组相比
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