Knockdown of IGF-1R Triggers Viral RNA Sensor MDA5- and RIG-I-Mediated Mitochondrial Apoptosis in Colonic Cancer Cells

doi:10.1016/j.omtn.2019.02.008

.2019年6月7:16:105-117。

doi:10.1016/j.omtn.2019.02.008。 Epub 2019年2月20日。

IGF-1R基因敲除触发病毒RNA传感器MDA5-和RIG-I介导的结肠癌细胞线粒体凋亡

王树清¹, 向雨阳², 新丰裕¹, 崔树祥^三, 仙君区⁴

附属机构

¹首都医科大学基础医学院药理学系，北京，中国。
²中国北京市海淀区航天中心医院口腔科。
^三首都医科大学公共卫生学院毒理学与卫生化学系北京市环境毒理学重点实验室，北京，中国。电子地址：sxccui@ccmu.edu.cn。
⁴首都医科大学基础医学院药理学系，北京，中国。电子地址：quxj@ccmu.edu.cn。

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内政部： 10.1016/j.omtn.2019.02.008

IGF-1R基因敲除触发病毒RNA传感器MDA5-和RIG-I介导的结肠癌细胞线粒体凋亡

王树清等。摩尔热核酸. 2019.

.2019年6月7:16:105-117。

doi:10.1016/j.omtn.2019.02.008。 Epub 2019年2月20日。

作者

王树清¹, 向雨阳², 新丰裕¹, 崔淑香^三, 仙君区⁴

附属机构

¹首都医科大学基础医学院药理学系，北京，中国。
²中国北京市海淀区航天中心医院口腔科。
^三首都医科大学公共卫生学院毒理学与卫生化学系北京市环境毒理学重点实验室，北京，中国。电子地址：sxccui@ccmu.edu.cn。
⁴首都医科大学基础医学院药理学系，北京，中国。电子地址：quxj@ccmu.edu.cn。

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摘要

胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R）在肿瘤发生中的重要作用已被证实。经典模型涉及IGF-1R与IGF-1/2结合，随后激活PI3K-Akt信号级联，驱动细胞增殖和凋亡抑制。本文报道了肠上皮中IGF-1R的一种新的信号转导途径。使用杂合敲除小鼠（Igf1r^+/-)，我们分析了病毒RNA传感器MDA5和RIG-I在肠上皮中的表达。免疫球蛋白1r^+/-与野生型（WT）小鼠相比，小鼠表现出更高的MDA5和RIG-I，这表明IGF-1R的敲低可以触发MDA5及RIG-I。IGF-1R敲低触发的MDA5和RIG-1在人类结肠癌细胞中被进一步研究。在癌细胞和IGF-1R沉默的正常人类结肠细胞的细胞质中可以清楚地看到MDA5和RIG-I的增加。值得注意的是，使用LY294002阻断PI3K-Akt通路并不影响MDA5和RIG-I的上调。这些结果提示了IGF-1R的一种新的信号转导途径。重要的是，IGF-1R敲除触发的MDA5和RIG-I通过激活线粒体途径导致结直肠癌细胞凋亡。这些体外观察结果在小鼠偶氮甲烷（AOM）-右旋糖酐硫酸钠（DSS）结直肠癌模型中得到证实。总之，IGF-1R的敲低触发了病毒RNA传感器MDA5和RIG-I介导的癌细胞线粒体凋亡。

关键词：IGF-1R；MDA5；钻机-I；线粒体凋亡；病毒RNA传感器。

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数字

图1
敲除IGF-1R触发的MDA5和RIG-I免疫球蛋白1r^+/负极小鼠（A）IHC分析了IGF-1R、MDA5和RIG-I在*免疫球蛋白1r*^+/负极小鼠及其WT同窝仔。蓝色染色通过DAPI鉴定结肠上皮细胞核。WT小鼠的IGF-1R（棕色）扩散染色比*免疫球蛋白1r*^+/负极老鼠。*免疫球蛋白1r*^+/负极小鼠MDA5（棕色）和RIG-I（棕色）弥漫性膜和细胞质染色显著增加，而WT小鼠仅在结肠隐窝基底细胞呈分散阳性。（B） WT大肠癌组织中IGF-1R和MDA5的免疫荧光染色*免疫球蛋白1r*^+/负极老鼠。第一帧：DAPI染色大肠上皮细胞核（第一列）。红色荧光染色显示IGF-1R在大肠上皮中表达。与WT小鼠（第一排）相比，*免疫球蛋白1r*^+/负极小鼠表现出IGF-1R表达降低（第二排）。第二帧：*免疫球蛋白1r*^+/负极小鼠MDA5（第二排，绿色荧光染色）高于WT小鼠（第一排，非常弱的绿色荧光染色法）。（C） Western blotting分析显示，结肠上皮中IGF-1R水平较低，MDA5和RIG-I水平较高*免疫球蛋白1r*^+/负极小鼠比WT小鼠。（n=6）**p<0.01，***p<0.001免疫球蛋白1r^+/负极老鼠和它们的WT室友。

图2
人类结肠癌细胞中IGF-1R触发子MDA5和RIG-I的敲除（A）免疫荧光染色分析显示IGF-1R沉默的HT-29细胞细胞质中MDA5增加（b，红色染色），而MDA5沉默不影响IGF-1Rs的表达（d）。（B）随着siIGF-1R浓度的增加，HT-29细胞IGF-1R表达呈剂量依赖性下降。MDA5和RIG-I随着IGF-1R表达的减少而相应增加。（C–E）MDA5、RIG-I和IGF-1R在HCT-116（C）、HT-29（D）和SW480（E）细胞系中的表达。转染siIGF-1R的细胞强烈触发MDA5和RIG-I（第二通道）。IGF-1增加IGF-1R（1μM）导致HCT-116和HT-29中MDA5表达（第三通道）下调。沉默MDA5对IGF-1R表达没有显著影响（第四通道）。用poly（I:C）转染的细胞导致MDA5和RIG-I表达强烈增加（最后一道）*与NC（阴性对照）细胞相比，p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图3
IGF-1R敲除触发的MDA5和RIG-I在（A）mRNA水平的结肠癌细胞系HT-29、HCT-116和SW480上发生，其表达水平在*mda5型*（**p<0.01，**p<0.001与NC）和*钻机-I*转染siIGF-1R后（##p<0.01 vs.NC）。（B） IGF-1治疗的细胞株降低了*mda5型*和*右侧I*，SW480除外。（C） poly（I:C）增加的MDA5和siMDA5沉默的MDA5都不影响*igf-1r*（D）LY294002处理的细胞不会影响癌细胞中MDA5和RIG-I的表达。

图4
在转染siIGF-1R的人类非恶性结肠上皮细胞（A）中，IGF-1R的敲除触发MDA5和RIG-I的人类结肠上皮（NCM460）细胞显示MDA5及RIG-I表达增加（第二通道）。IGF-1激活IGF-1R，略微下调MDA5和RIG-I（第三车道）。转染siMDA5的细胞不会影响IGF-1R的表达（第四通道）。用poly（I:C）转染的细胞导致MDA5和RIG-I（最后一道）增加。（B）敲除IGF-1R触发的MDA5和RIG-I发生在mRNA水平*与NC细胞相比，p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。（C）三种结肠癌细胞系和正常结肠上皮细胞中MDA5和RIG-I增加的比较。与人类结肠上皮正常细胞相比，癌细胞对IGF-1R敲低触发MDA5和RIG-I的反应更高*结肠癌细胞系与正常上皮细胞之间p<0.05，**p<0.01。

图5
IGF-1R敲除触发的MDA5和RIG-I通过线粒体途径介导的人结肠癌细胞（A）Annexin V-FITC-PI染色分析显示，转染siIGF-1R和poly（I:C）的HT-29细胞凋亡增加。转染siMDA5不会诱导细胞凋亡。用poly（I:C）、siIGF-1R、siMDA5和IGF-1处理48小时后的（B，a）HT-29细胞存活。siIGF-1和poly（I：C）的转染强烈抑制了细胞存活，但siMDA5。与对照细胞相比，IGF-1显著刺激细胞生长。随着poly（I:C）浓度的增加，HT-29细胞存活受到剂量依赖性抑制。用siIGF-1R（50μM）转染的细胞获得了与poly（I:C）相同的疗效。（C） HT-29细胞JC-1探针染色显示，IGF-1R沉默的癌细胞中MMP丢失，绿色荧光增强（第二排），与poly（I:C）（第三排）的作用类似。（D） Western blotting分析显示Bim和细胞色素增加*c（c）*在HT-29细胞中，IGF-1R沉默（第四通道）。活化Bim和细胞色素的功效*c（c）*沉默的IGF-1R高于poly（I:C）（最后一条车道）*与NC细胞相比，p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图6
IGF-1R敲除触发的MDA5和RIG-I介导的线粒体凋亡导致肿瘤抑制*免疫球蛋白1r*^+/负极老鼠*免疫球蛋白1r*^+/负极将小鼠及其WT窝友暴露于AOM-DSS诱导结直肠癌。（A）*免疫球蛋白1r*^+/负极小鼠结肠上皮MDA5和RIG-I水平高于WT小鼠。（B）*免疫球蛋白1r*^+/负极与WT小鼠（左）相比，小鼠发生的结肠肿瘤较少，显示肿瘤发生率（中）和大小（右）降低。（C）组织病理学分析显示，WT小鼠出现晚期腺癌，而在*免疫球蛋白1r*^+/负极老鼠。（D） IHC分析显示，在WT小鼠结直肠癌中Ki-67和PCNA呈强扩散染色，而在WT鼠结直肠癌隐窝基底细胞中仅呈分散阳性*免疫球蛋白1r*^+/负极老鼠。（E） TUNEL染色分析显示*免疫球蛋白1r*^+/负极老鼠。（F）蛋白质印迹分析显示Bim和凋亡体（细胞色素*c（c）*，凋亡肽酶激活因子1[Apaf-1]和胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-3）*免疫球蛋白1r*^+/负极小鼠（n=6）*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001免疫球蛋白1r^+/负极-A/D和WT-A/D.A/D，AOM-DSS。

图7
IGF-1R触发的MDA5和RIG-I的敲除可能独立于PI3K-Akt途径（A）人类结肠上皮（NCM460）细胞和结肠癌细胞HCT-116、HT-29和SW480暴露于10μM SC79 1.5小时。SC79增加了这些细胞系中p-Akt的水平（无SC79和有SC79的细胞之间，*p<0.05，**p<0.01）。与不含SC79的细胞系相比，这些细胞系中的MDA5没有显著变化（p<0.05）。（B）用AKT抑制剂VIII（5μM）处理细胞1.5 h，然后测定p-AKT和MDA5的水平。p-AKT水平显著降低（在无AKT抑制剂VIII和有AKT抑制剂Ⅷ的细胞之间，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。与没有AKT抑制剂VIII的细胞相比，MDA5没有显著变化（p<0.05）。（C）用poly（I:C）（200 ng/mL）处理细胞24 h，然后分析MDA5和p-AKT水平。多聚物（I:C）可增加MDA5水平（无多聚物和有多聚物的细胞之间，*p<0.05，**p<0.01）。无poly（I:C）和有poly（I：C）的细胞间p-AKT无明显变化（p<0.05）。（D）用siMDA5处理细胞24小时，然后测定p-AKT水平（**p<0.01，***p<0.001）。经poly（I:C）处理的细胞株和未经poly的细胞株中p-AKT的表达水平没有差异（p<0.05）。（E）*免疫球蛋白1r*^+/负极将小鼠及其WT窝友暴露于AOM-DSS诱导结直肠癌。然后用SC79（0.04 mg/g，i.p.）治疗小鼠2周。*免疫球蛋白1r*^+/负极与WT小鼠（第一排和第二排）相比，小鼠表现出更低的p-AKT（***p<0.001）和更高的MDA5（##p<0.01）。在肿瘤发生过程中，AOM-DSS诱导两种细胞的p-AKT升高*免疫球蛋白1r*^+/负极小鼠和*免疫球蛋白1r*^+/负极暴露于SC79的小鼠（**p<0.01，***p<0.001与不使用AOM-DSS的小鼠相比）和WT小鼠（**p<0.01，***p<0.001 vs不使用AOM-DSS），其中WT小鼠表现出最高水平的PCNA，仅次于*免疫球蛋白1r*^+/负极SC79和*免疫球蛋白1r*^+/负极不含SC79的小鼠（与WT相比p<0.01）。MDA5在*免疫球蛋白1r*^+/负极接触SC79和不接触SC79的小鼠（p<0.05）。

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