跳到主页面内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息,确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https(https)://确保您连接到官方网站,并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2019年3月8日;11(3):339.
doi:10.3390/cancers11030339。

连接蛋白43缺失触发非肿瘤乳腺上皮细胞周期进入和侵袭:非规范Wnt信号的作用

附属公司

连接蛋白43缺失触发非肿瘤乳腺上皮细胞周期进入和侵袭:非规范Wnt信号的作用

萨布琳·福斯托克等。 癌症(巴塞尔). .

摘要

(1) 背景:连接蛋白43(Cx43)在乳腺癌中的表达受到干扰,该蛋白在人类乳腺癌细胞系中的重新表达导致增殖和侵袭性降低,提示其具有抑癌作用。本研究旨在研究Cx43在非肿瘤性乳腺上皮细胞增殖和侵袭中的作用。(2) 方法:在二维和三维条件下培养非致瘤性人乳腺上皮HMT-3522 S1细胞和Cx43 shRNA转染的相应细胞。(3) 结果:沉默Cx43可导致β-catenin和Scrib在三维培养的腺体结构或腺泡的顶外侧膜域定位错误,提示顶端极性丧失。细胞周期进入和增殖增强,同时c-Myc和cyclin D1上调,但未观察到Wnt/β-catenin信号的可检测激活。运动性和侵袭性也被触发,并与腺泡形态改变、ERK1/2和Rho-GTPase信号的激活有关,后者作用于非经典Wnt通路的下游。只有在细胞外基质(ECM)的允许硬度下才能观察到Cx43-shRNA S1细胞的侵袭。(4) 结论:我们的结果表明,Cx43通过调节非经典Wnt信号通路,在一定程度上控制正常乳腺上皮的增殖和侵袭。

关键词:Wnt途径;乳腺癌;连接蛋白43;缝隙连接;入侵;乳腺上皮;乳腺;微环境;运动性;增殖。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
在2-D和3-D培养条件下,沉默Cx43可提高S1细胞的增殖速率。S1和Cx43-shRNA S1细胞(Cx43 KO)在2-D条件下培养(A类)或三维条件(B类). 通过2D中第6天和第10天的细胞计数评估增殖率(A类; 上面板),并在第4天、第6天、第9天和第11天测量腺泡直径(B类; 右侧面板)。使用目镜测微计校准阶段测微计,然后计算腺泡面积并绘制为腺泡大小。每组分析50个腺泡。直方图中所示的值是细胞计数的平均值(±S.D.)(A类; 上面板)或腺泡尺寸(B类; 右面板)。未付款t吨-测试*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001. 第11天的二维细胞代表性图像(A类; 下部面板)和三维(B类; 左面板)。细胞核用Hoechst染色(蓝色;B类; 左下面板)。
图2
图2
在二维和三维培养条件下,沉默Cx43触发细胞周期进入并上调S1细胞中细胞周期基因的表达。S1和Cx43-shRNA S1细胞(Cx43 KO)在2-D条件下培养(A类,C类; 左面板)或三维条件(B类,C类; 右侧面板)。A和B。通过流式细胞术在第4、6、9和11天以二维形式进行细胞周期分析(A类)以及第4天和第11天的3D(B类). 直方图中所示的值是三个独立实验中不同细胞周期阶段细胞百分比的平均值(±S.D.)。未付款t吨-测试*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001. (C类)在第4天、第6天、第9天和第11天提取2D(左侧面板)和第11天后提取3D(右侧面板)的总蛋白。通过Western blotting检测c-Myc和cyclin D1的表达。拉明B担任装载控制。直方图(右下面板)中所示的值是三维c-Myc或cyclin D1表达折叠变化的平均值,与三个独立实验得出的Lamin B表达折叠变化一致。S1细胞中标准化表达的折叠变化设置为1。
图2
图2
在二维和三维培养条件下,沉默Cx43触发细胞周期进入并上调S1细胞中细胞周期基因的表达。S1和Cx43-shRNA S1细胞(Cx43 KO)在2-D条件下培养(A类,C类; 左面板)或三维条件(B类,C类; 右侧面板)。A和B。通过流式细胞术在第4、6、9和11天以二维形式进行细胞周期分析(A类)以及第4天和第11天的3D(B类). 直方图中所示的值是三个独立实验中不同细胞周期阶段细胞百分比的平均值(±S.D.)。未付款t吨-测试*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001. (C类)在第4天、第6天、第9天和第11天提取2D(左侧面板)和第11天后提取3D(右侧面板)的总蛋白。通过Western blotting检测c-Myc和cyclin D1的表达。拉明B担任装载控制。直方图(右下面板)中所示的值是三维c-Myc或cyclin D1表达折叠变化的平均值,与三个独立实验得出的Lamin B表达折叠变化一致。S1细胞中标准化表达的折叠变化设置为1。
图3
图3
在二维培养条件下,Cx43在S1细胞中组装GJ复合物。S1细胞在二维条件下培养。第6天提取总蛋白。通过Cx43的免疫共沉淀(IP)和蛋白质印迹检测Cx43、β-连环蛋白和ZO-2来评估Cx43和β-连环蛋白(上图)或ZO-2(下图)的相关性。输入用作控件。对Cx43-β-catenin关联进行了三个独立实验,对Cx43-ZO-2关联进行了两个独立实验。
图4
图4
沉默Cx43可以在三维培养条件下改变S1细胞中连接蛋白和极性蛋白的定位,而不会影响其表达水平。S1和Cx43-shRNA S1细胞(Cx43 KO)在二维或三维条件下培养。(A类)在第9天提取2D(左侧面板)和第11天提取3D(右侧面板)的总蛋白。通过蛋白质印迹法评估Scrib、ZO-2、β-catenin和Cx43的表达。拉明B担任装载控制。进行了三个独立的实验。直方图(右侧面板)中所示的值是三个独立实验中Cx43表达的三维折叠变化的平均值,并将其归一化为Lamin B的折叠变化。S1细胞中标准化表达的折叠变化设置为1。(B类)在第9天的2D(左上面板)和第11天的3D(左下面板)中,通过免疫荧光检测β-catenin(红色)的定位。细胞核用Hoechst(蓝色)复染。直方图中所示的值是三个独立实验中腺泡百分比与顶端β-catenin的平均值(±S.D.)。每组分析100个腺泡。未付款t吨-测试**第页<0.01。(C类)在第12天的二维(左上面板)和第11天的三维(左下面板)中,通过免疫荧光评估Scrib(红色)的定位。细胞核用Hoechst(蓝色)复染。直方图中所示的值是三个独立实验中尖外侧Scrib腺泡百分比的平均值(±S.D.)。每组分析100个腺泡。未付款t吨-测试***第页< 0.001.
图4
图4
沉默Cx43可以在三维培养条件下改变S1细胞中连接蛋白和极性蛋白的定位,而不会影响其表达水平。S1和Cx43-shRNA S1细胞(Cx43 KO)在二维或三维条件下培养。(A类)在第9天提取2D(左侧面板)和第11天提取3D(右侧面板)的总蛋白。通过Western blotting评估Scrib、ZO-2、β-catenin和Cx43的表达。拉明B担任装载控制。进行了三个独立的实验。直方图(右侧面板)中所示的值是三个独立实验中Cx43表达的三维折叠变化的平均值,并将其归一化为Lamin B的折叠变化。S1细胞中标准化表达的折叠变化设置为1。(B类)在第9天的2D(左上面板)和第11天的3D(左下面板)中,通过免疫荧光检测β-catenin(红色)的定位。细胞核用Hoechst(蓝色)复染。直方图中所示的值是三个独立实验中腺泡百分比与顶端β-catenin的平均值(±S.D.)。每组分析100个腺泡。未付款t吨-测试**第页<0.01。(C类)在第12天的二维(左上面板)和第11天的三维(左下面板)中,通过免疫荧光评估Scrib(红色)的定位。细胞核用Hoechst(蓝色)复染。直方图中所示的值是三个独立实验中腺泡百分比的平均值(±S.D.)。每组分析100个腺泡。未付款t吨-测试***第页< 0.001.
图5
图5
在三维培养条件下,沉默Cx43激活S1细胞中的MAPK信号,但不激活Wnt/β-catenin信号。S1和Cx43-shRNA S1细胞(Cx43 KO)在2-D条件下培养(A类)或三维条件(A类——). (A类,B类,)在第4天、第9天和第11天提取2-D中的总蛋白(A类; 左侧面板)和第11天的3D(A类; 右侧面板,B类,). Western blotting检测β-catenin、p-β-catening、GSK-3α/β、p-GSK-3β/β、ERK1/2和p-ERK1/2的表达。拉明B和GAPDH用作装载控制。进行了三个独立的实验。直方图中描述的值(; 右面板)是从三个独立实验中归一化为GAPDH的三维p-ERK1/2水平折叠变化的平均值。S1细胞中标准化水平的折叠变化设置为1。(C类)在第11天(S1和Cx43 KO细胞)或第7天(3-D细胞)提取核蛋白。用Western blotting检测β-catenin水平。拉明B担任装载控制。通过分析细胞溶质(GAPDH)和膜标记物(Tim23)确定核组分的纯度。对第11天提取的3D(S1细胞)总蛋白进行联合分析,作为检测GAPDH和Tim23的对照。进行了三个独立的实验。
图5
图5
在三维培养条件下,沉默Cx43激活S1细胞中的MAPK,但不激活Wnt/β-catenin信号传导。S1和Cx43-shRNA S1细胞(Cx43 KO)在2-D条件下培养(A类)或三维条件(A类——). (A类,B类,)在第4天、第9天和第11天提取2D中的总蛋白(A类; 左侧面板)和第11天的3D(A类; 右侧面板,B类,). Western blotting检测β-catenin、p-β-catening、GSK-3α/β、p-GSK-3β/β、ERK1/2和p-ERK1/2的表达。拉明B和GAPDH用作装载控制。进行了三个独立的实验。直方图中描述的值(; 右面板)是从三个独立实验中归一化为GAPDH的三维p-ERK1/2水平折叠变化的平均值。S1细胞中标准化水平的折叠变化设置为1。(C类)在第11天(S1和Cx43 KO细胞)或第7天(3-D细胞)提取核蛋白。用Western blotting检测β-catenin水平。拉明B担任装载控制。通过分析细胞溶质(GAPDH)和膜标记物(Tim23)确定核组分的纯度。在3-D(S1细胞)中在第11天提取的总蛋白被共同分析作为检测GAPDH和Tim23的对照。进行了三个独立的实验。
图6
图6
沉默Cx43可诱导S1细胞运动和侵袭。(A) 在二维条件下培养S1和Cx43-shRNA S1细胞(Cx43 KO)。第5天通过延时成像评估运动能力。显示了延时电影(上面板)中代表性S1和Cx43 KO单元的总路径(不同颜色代表不同的单元)。直方图显示了细胞运动的量化。每组共分析50个细胞。所示值是两个独立实验的总路径长度(左下面板)或迁移速度(右下面板)的平均值(±S.D.)。未付款t吨-测试**第页<0.01。(B) 通过跨阱细胞侵袭试验(上图)评估S1和Cx43 KO细胞在稀释Matrigel(1:5)上的侵袭。直方图中所示的值是三个独立实验中Matrigel-invading细胞数量的折叠变化平均值(±S.D.)。未付款t吨-测试**第页<0.01。显示了在二维条件下培养的细胞的代表性图像,并在第5天(下面板)对其进行了F-actin染色。箭头表示入侵类富含肌动蛋白的圆点。(C) S1和Cx43 KO细胞在不同Matrigel稀释液(未稀释、1:5、1:10和1:20稀释液)上的三维条件下培养。在第11天通过计数非球形结构来评估侵袭。每组分析100个结构。直方图(上部面板)中所示的值是三个独立实验中非球形结构的平均值(±S.D.)。未付款t吨-测试***第页< 0.001. 显示了单元格的代表性图像(下面板)。箭头表示迁移的Cx43 KO细胞。Undil;未稀释。
图6
图6
沉默Cx43可诱导S1细胞运动和侵袭。(A) 在二维条件下培养S1和Cx43-shRNA S1细胞(Cx43 KO)。第5天通过延时成像评估运动能力。显示了延时电影(上面板)中代表性S1和Cx43 KO单元的总路径(不同颜色代表不同的单元)。直方图显示了细胞运动的量化。每组共分析50个细胞。所示值是两个独立实验的总路径长度(左下面板)或迁移速度(右下面板)的平均值(±S.D.)。未付款t吨-测试**第页<0.01。(B) 通过跨阱细胞侵袭试验(上图)评估S1和Cx43 KO细胞在稀释Matrigel(1:5)上的侵袭。直方图中所示的值是来自三个独立实验的基质胶侵入细胞数量的倍数变化的平均值(±S.D.)。未付款t吨-测试**第页<0.01。显示了在二维条件下培养的细胞的代表性图像,并在第5天(下面板)对其进行了F-actin染色。箭头表示入侵类富含肌动蛋白的圆点。(C) S1和Cx43 KO细胞在不同Matrigel稀释液(未稀释、1:5、1:10和1:20稀释液)上的三维条件下培养。在第11天通过计数非球形结构来评估侵袭。每组分析100个结构。直方图(上部面板)中所示的值是三个独立实验中非球形结构的平均值(±S.D.)。未付款t吨-测试***第页< 0.001. 显示了单元格的代表性图像(下面板)。箭头指示迁移的Cx43 KO细胞。Undil;未稀释。
图7
图7
S1细胞在ECM硬度降低的三维培养条件下保持其特有的球形形态、管腔形成能力和极性。S1细胞在不同基质稀释液(未稀释、1:5、1:10和1:20稀释液)上的三维条件下培养。流明形成(A类)和极性(B类)经Scrib顶外侧定位显示(红色;B类; 左侧面板),于第11天进行免疫荧光检测。(A类)每种情况分析50个腺泡。直方图(右侧面板)中所示的值是三个独立实验中腺泡百分比与管腔的平均值(±S.D.)。未付款t吨-测试*第页< 0.05, ***第页< 0.001. 显示了腺泡的代表性图像(左面板)。细胞核用Hoechst染色(蓝色;左下面板)。(B类)对每种情况下的67个腺泡进行分析。直方图(右侧面板)中所示的值是两个独立实验中带Scrib顶外侧腺泡百分比的平均值(±S.D.)。未付款t吨-测试。显示了腺泡的代表性图像(左面板)。细胞核用Hoechst(蓝色)复染。Undil;未稀释。
图8
图8
在二维和三维培养条件下,沉默Cx43上调S1细胞中Rho GTPases的表达和活性。S1和Cx43-shRNA S1细胞(Cx43 KO)在2-D条件下培养(A类),未稀释的三维条件(B类)或稀释Matrigel(1:5;C类). 第9天提取2-D总蛋白(A类)和第11天的3D(B类,C类). 通过Western blotting评估RhoA、Cdc42和Rac1的表达。拉明B和GAPDH用作装载控制。进行了三个独立的实验。通过下拉试验评估Rho GTPases的活性,然后通过Western blotting检测活性Rho TGPases。进行了三个独立的实验。

类似文章

引用人

工具书类

    1. Monaghan P.、Perusinghe N.、Carlie G.、Evans W.H.在怀孕、哺乳和退化期间对小鼠乳腺缝隙连接表达的快速调节。J.组织化学。细胞化学。1994;42:931–938. doi:10.1177/42.78014476。-内政部-公共医学
    1. Locke D.、Perusinghe N.、Newman T.、Jayatilake H.、Evans W.H.、Monaghan P.小鼠乳腺中连接蛋白的发育表达和组装成同源和异源缝隙连接半通道。J.细胞。生理学。2000年;183:228–237页。doi:10.1002/(SICI)1097-4652(200005)183:2<228::AID-JCP9>3.0.订单2年。-内政部-公共医学
    1. Locke D.、Stein T.、Davies C.、Morris J.、Harris A.L.、Evans W.H.、Monaghan P.、Gusterson B.在乳腺发育过程中改变了连接蛋白通道的通透性和调节特性。实验细胞研究2004;298:643–660. doi:10.1016/j.yexcr.2004.05.003。-内政部-公共医学
    1. Locke D.、Jamieson S.、Stein T.、Liu J.、Hodgins M.B.、Harris A.L.、Gusterson B.成年小鼠乳腺中含Cx30通道的性质。细胞组织研究2007;328:97–107. doi:10.1007/s00441-006-0301-6。-内政部-公共医学
    1. Talhouk R.S.、Elble R.C.、Bassam R.、Daher M.、Sfeir A.、Mosleh L.A.、El-Khoury H.、Hamoui S.、Pauli B.U.、El-Sabban M.E.小鼠乳腺中连接蛋白的发育表达模式和调控:乳汁生成中连接蛋白30的表达。细胞组织研究2005;319:49–59. doi:10.1007/s00441-004-0915-5。-内政部-公共医学