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.2019年2月22日10:99。
doi:10.3389/fneur.2019.00099。 2019年电子采集。

高速超压对星形胶质细胞的机械活化涉及结构和连接蛋白的改变

诺拉·拉瓦克 1, 帕梅拉·范德沃德 1 2
附属公司

高速超压对星形胶质细胞的机械活化涉及结构和连接蛋白的改变

诺拉·拉瓦克等。 前Neurol. .

摘要

原发性爆炸性神经损伤是一种独特的损伤模式，其特点是对脑组织产生高速超压效应。突发性神经损伤的一个主要特征是胶质细胞的反应性，尤其是星形胶质细胞的激活时间延长。这种细胞反应主要是通过增加中间丝表达在原发性原发性母细胞瘤中定义的。由于中间丝网络与跨膜蛋白物理接触以提供连接支持，因此推测细胞连接调控在反应表型中也发生了改变。这将通过信号转导途径，如活化B细胞的核因子κ-轻链增强子（NF-κB），对下游转录调控产生影响。因此，为在体外在大鼠冲击性神经损伤模型中使用基于颅内压测量的机械条件进行的测试。将原代大鼠星形胶质细胞暴露于孤立的高速机械刺激下，以研究与其机械活化相关的细胞连接动力学。首先，通过评估胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和增殖细胞核抗原（PCNA）的表达来设计反应性“经典”特征的时间进程。随后是缝隙连接（连接蛋白）和锚定连接蛋白（整合素和钙粘蛋白）的基因和蛋白表达。通过核定位NF-κB p65和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）p38两个分子进行信号转导分析。结果表明，在超压后24小时，连接蛋白43的表达和PCNA首先显著增加(第页<0.05），其次是结构反应性（通过增加GFAP，第页<0.05）对应于超压后48小时锚结动力学增加(第页< 0.05). 此外，除了p65和p38的核定位增加外，还观察到黏着斑激酶（FAK）磷酸化增加(第页<0.05）。为了评估细胞核中p65的转录活性，对紧密连接拮抗剂细胞内粘附分子-1（ICAM-1）启动子区域的结合位点进行了电泳迁移率变化分析。核蛋白与ICAM-1上NF-κB位点相互作用的显著增加对应于ICAM-1基因和蛋白表达的增加(第页< 0.05). 总之，这些结果表明，在高速过压后星形胶质细胞的机械活化中，涉及细胞连接动力学的多个靶点和相应的信号通路。

关键词：ICAM-1；星形胶质细胞；钙粘蛋白；连接蛋白；整合素；超压；反应性。

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数字

图1
图1
研究人群为第0代至第4代之间GFAP阳性的原代大鼠星形胶质细胞。在图像中，用GFAP免疫标记细胞并用FITC标记细胞。比例尺为75μm。
图2
图2
HOS是一个充满水的腔室在体外样品通过爆炸桥丝机制达到高速超压。（A）发电机由四个主要部件组成。（i） 电容器（ii）电路机构（iii）线桥（内部）（iv）线桥。（B）模拟的高速率超压剖面设计用于模拟来自体内爆破试验。
图3
图3
经典反应性标记标准化蛋白表达的时间进程分析。与各自的假体相比，超压组在48小时时GFAP显著升高，而PCNA在24、48和72小时时升高。*第页<0.05，数据表示为平均值±SEM，n个=8–13/组。
图4
图4
MTT代谢活性正常。与假手术组相比，超压暴露后48小时观察到显著变化。*第页<0.05，数据表示为平均值±SEM，n个=8–9/组。
图5
图5
细胞连接靶点的基因和蛋白质表达。（A）基因表达分析显示，与假手术组相比，高速超压后24小时间隙连接（CX43）调节增强，48小时锚定连接（整合素）调节增强。vinculin mRNA表达无变化。（B）Western blot结果证实，与假手术组相比，过压后24小时CX43蛋白水平增加。（C）与假手术组相比，过压后48小时，锚定连接蛋白整合素-β1和N-钙粘蛋白显著升高。*第页<0.05，数据表示为平均值±SEM，基因：n个=7–9/组，蛋白质：n个=11–12/组。
图6
图6
全细胞和核信号转导蛋白的Western blot分析。（A）与假手术组相比，磷酸化FAK（Y397）在24小时显著降低，在48小时显著升高。（B）与假手术组相比，相应信号转导分子p38和p65的核定位在24小时降低，在48小时增加。*第页< 0.05,#第页=0.056，数据表示为平均值±SEM，整个单元格：n个=9–10/组；核能：n个=7–9/组。
图7
图7
EMSA结果显示核蛋白与ICAM-1启动子序列的结合效率。（A）对蛋白与感兴趣的NF-κB结合序列的特异性进行了检测优化。将同一样品与未标记的DNA序列孵育，以确保竞争性结合。第一条通道包含标记和未标记的DNA，而第二条通道仅包含标记的DNA。（B）代表性DNA：显示了假手术组和超压手术组的蛋白质移位。结合到游离DNA的量化结果表明，超压诱导核蛋白与ICAM-1启动子上NF-κB结合位点的关联显著增加。*第页<0.05，数据表示为平均值±SEM，n个=6-8/组。
图8
图8
ICAM-1的正常基因和蛋白表达。（A）qPCR结果表明，与假手术组相比，超压后24小时ICAM-1的mRNA表达没有变化，但在48小时时显著增加。（B）随后的Western blot结果证实，与假手术组相比，48小时时ICAM-1蛋白水平升高。*第页<0.05，数据表示为平均值±SEM，基因：n个=7–9/组，蛋白质：n个=8–9/组。
图9
图9
通过5-甲基胞嘧啶荧光标记评估整体DNA甲基化。与假手术组相比，超压暴露后24小时发生高甲基化。在48小时时未观察到甲基化的变化。*第页<0.05，数据表示为平均值±SEM，n个=10–12/组。
图10
图10
机械活化星形胶质细胞中调节连接变化和结构反应性的潜在信号反馈机制的简单概述。这些目标中的多个与在高速率超压暴露模型中观察到的经典反应性特征一致。
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