Involvement of autophagy in hypoxia-BNIP3 signaling to promote epidermal keratinocyte migration

doi:10.1038/s41419-019-1473-9

.2019年3月8日；10(3):234.

doi:10.1038/s41419-019-1473-9。

自噬参与低氧-BNIP3信号传导促进表皮角质形成细胞迁移

张俊辉¹, 张灿（Can Zhang）¹, 徐品江¹, 李凌飞¹, 张东霞¹, 狄唐¹, 田田燕^1 2, 张琼（音）¹, 袁宏平¹, 贾杰芝¹, 胡炯宇^1 三, 张嘉平^1 4, 黄月生⁵

附属机构

¹中国重庆陆军医科大学（第三军医大学）西南医院创伤、烧伤及复合伤国家重点实验室烧伤研究所。
²中国驻马店，中国人民解放军第990（159）医院军事烧伤中心。
^三中国重庆陆军医科大学（第三军医大学）西南医院内分泌科。
⁴中国重庆陆军医科大学（第三军医大学）西南医院整形外科。
⁵中国重庆陆军医科大学（第三军医大学）西南医院创伤、烧伤及复合伤国家重点实验室烧伤研究所。yshuangtmmu@163.com。

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PMCID公司： PMC6408485型
内政部： 10.1038/s41419-019-1473-9

自噬参与低氧-BNIP3信号传导促进表皮角质形成细胞迁移

张俊辉等。细胞死亡病. 2019.

.2019年3月8日；10(3):234.

doi:10.1038/s41419-019-1473-9。

作者

张俊辉¹, 张灿（Can Zhang）¹, 徐品江¹, 李凌飞¹, 张东霞¹, 狄唐¹, 田田燕^1 2, 张琼（音）¹, 袁宏平¹, 贾杰芝¹, 胡炯宇^1 三, 张嘉平^1 4, 黄月生⁵

附属机构

¹中国重庆陆军医科大学（第三军医大学）西南医院创伤、烧伤及复合伤国家重点实验室烧伤研究所。
²中国驻马店解放军第990（159）医院军事烧伤中心。
^三中国重庆陆军医科大学（第三军医大学）西南医院内分泌科。
⁴中国重庆陆军医科大学（第三军医大学）西南医院整形外科。
⁵中国重庆陆军医科大学（第三军医大学）西南医院创伤、烧伤及复合伤国家重点实验室烧伤研究所。yshuangtmmu@163.com。

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勘误表in

作者更正：自噬参与低氧-BNIP3信号传导，促进表皮角质形成细胞迁移。
张J、张C、蒋X、李莉、张D、唐D、闫T、张Q、袁H、贾J、胡J、张J、黄Y。张杰等。细胞死亡疾病。2019年4月1日；10(4):295. doi:10.1038/s41419-019-1533-1。细胞死亡疾病。2019 采购管理信息：30931925 免费PMC文章。

摘要

BNIP3是Bcl-2家族中仅有BH3的非典型成员，具有促死亡、促自噬和细胞保护功能，这取决于应激类型和细胞环境。最近，我们证明BNIP3在缺氧条件下刺激表皮角质形成细胞的迁移。本研究发现，在伤口愈合过程中，自噬和BNIP3表达在迁移表皮中以低氧依赖性方式同时升高。通过溶酶体特异性化学物质（CQ和BafA1）或靶向Atg5的小干扰RNA抑制自噬，大大减弱了缺氧诱导的细胞迁移，角质形成细胞中BNIP3的敲低显著抑制了缺氧诱导的自噬激活和细胞迁移，提示BNIP3诱导的自噬在角质形成细胞迁移中发挥积极作用。此外，这些结果表明，缺氧引起的活性氧（ROS）积累触发了人类永生化角质形成细胞HaCaT细胞中p38和JNK有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活。反过来，激活的p38和JNK MAPK介导BNIP3诱导的自噬激活和角朊细胞迁移的增强。这些数据揭示了一个先前未知的机制，即BNIP3诱导的自噬是通过低氧诱导的ROS介导的p38和JNK MAPK活化发生的，并支持伤口愈合过程中表皮角质形成细胞的迁移。

PubMed免责声明

利益冲突声明

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数字

**图1。创伤愈合过程中BNIP3上调和表皮自噬激活。**
一从C57BL/6小鼠获得的正常未损伤皮肤（第0天）和第5天、第10天和第15天损伤切片中BNIP3、LC3和Atg5的免疫荧光染色显示，在正常伤口再上皮化过程中，BNIP3上调，迁移表皮中自噬激活。伤口在第10天接近再上皮化，在第15天完全再上皮化。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）染色。比例尺 = 50 微米。*Epi公司*表皮，*Derm公司*真皮。窄虚线表示表皮和真皮之间的界面或迁移表皮的前缘（第5天和第10天）。**b–d段**图表显示了由ImageJ软件确定的相对荧光强度。结果用平均值表示 ± 扫描电镜(n个 = 3).e（电子）所示伤口标本在裂解缓冲液中进行裂解，并用于检测LC3、Atg5、Atg7、Atg16L1、Beclin-1、p-ULK1和BNIP3。**（f）**将指示的伤口标本在裂解缓冲液中进行裂解，并用抗BNIP3或抗LC3抗体进行免疫沉淀，然后用抗LC3或抗BNIP4抗体进行免疫印迹。^**P（P）* < 0.05 vs.第0天组

**图2。自噬在缺氧角质形成细胞中被激活，是细胞迁移所必需的。**
一将HaCaT细胞暴露于低氧（2%）下并孵育指定时间，收集总蛋白，通过Western blotting检测自噬标记物（LC3、P62、Atg5、Atg7、Atg16L1、Beclin-1和p-ULK1）。GAPDH被用作负荷控制。b条HaCaT细胞暴露于缺氧（2%）6 透射电镜观察h和自噬体。显示了具有代表性的显微照片。方框中的区域表示更高的放大倍数，以说明细节。红色箭头表示自噬液泡。比例尺 = 1微米。*百万吨*线粒体。**c（c）**用放线菌素D（ACTD，5 nM）1 h抑制转录，然后孵育6 常压或缺氧条件下h。GAPDH被用作负荷控制。**d–i日**HaCaT细胞暴露于低氧（2%）并孵育6 h.自噬抑制剂，即氯喹（CQ，10 μM）和巴非霉素A1（BafA1，10 nM），加入1 缺氧暴露前h。用所示抗体对提取的蛋白质进行免疫印迹(d日).e（电子）荧光染色显示HaCaT细胞中LC3表达（绿色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。伤口愈合分析(**（f）**,克)和单细胞运动分析(小时,我)检测自噬抑制剂对角质形成细胞迁移的影响。伤口愈合的典型图像，包括角质形成细胞轨迹。比例尺 = 100 微米。定量结果用平均值表示 ± 扫描电镜(n个 = 3).^**P（P）* < 0.05与正常组相比，以及^#*P（P）* < 0.05与Hypo组比较。jWestern blotting用于分析经100 在指定条件下，nM Atg5 siRNA（siAtg5）或siRNA-阴性对照（siNC）。GAPDH被用作负荷控制。Atg5 siRNA对角质形成细胞迁移的影响也通过伤口愈合试验测定(k个,我)和单细胞运动(米,n个)分析。伤口愈合的典型图像，包括角质形成细胞轨迹。比例尺 = 100 微米。定量结果用平均值表示 ± 扫描电镜(n个 = 3).^**P（P）* < 0.05与正常组相比，以及^#*P（P）* < 0.05与Hypo组比较。标准常氧，海波缺氧

**图3。BNIP3通过调节自噬促进角质形成细胞迁移。**
利用慢病毒建立shBNIP3稳定转染的HaCaT细胞和对照细胞（shNC）。一Western blotting检测稳定转染HaCaT细胞中BNIP3和LC3的表达水平。GAPDH被用作负荷控制。b条通过共焦显微镜观察HaCaT细胞中LC3（绿色）和BNIP3（红色）的结合。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺 = 25 微米。单细胞运动分析(**c（c）**,d日)和伤口愈合分析(**e（电子）**,**（f）**)使用所指示的细胞进行。伤口愈合的典型图像，包括角质形成细胞轨迹。比例尺 = 100 微米。定量分析的结果用平均值表示 ± 扫描电镜(n个 = 3).^**P（P）* < 0.05与正常组，^#*P（P）* < 0.05与Hypo组

**图4。缺氧诱导的ROS生成增加会在体内驱动表皮BNIP3的表达。**
新生小鼠背被的皮肤标本在6孔板中培养，并暴露于缺氧（2%O₂)用于6 h.添加N-乙酰半胱氨酸（NAC）抗氧化剂1 缺氧暴露前h。一器官培养后，对皮肤切片进行二氢乙炔（DHE）和LC3或BNIP3共染色。蓝色信号（DAPI）表示细胞核染色。虚线表示表皮和真皮之间的边界。比例尺 = 25 微米。**b–d段**图表显示了由ImageJ软件确定的相对荧光强度。结果用平均值表示 ± 扫描电镜(n个 = 3).^**P（P）* < 0.05与正常组，以及^#*P（P）* < 0.05 vs.Hypo组。**e（电子）**采用Western blot分析NAC缺氧时培养皮肤中BNIP3、LC3、P62、Atg5、Atg7、Atg16L1、Beclin-1和p-ULK1的表达。显示了每组两个样品的代表谱带。GAPDH被用作负荷控制。**（f）**将指示的培养皮肤在裂解缓冲液中进行裂解，然后用抗BNIP3或抗LC3抗体进行免疫沉淀，随后用抗LC3或抗BNIP4抗体进行免疫印迹

**图5。BNIP3上调与体外缺氧条件下活性氧的产生有关。**
HaCaT细胞缺氧6 h.添加NAC 1 缺氧暴露前h。一缺氧暴露后，处理HaCaT细胞进行DHE免疫染色。蓝色信号（DAPI）表示核染色，并显示代表性图像。比例尺 = 100 微米。b条图中显示了一由ImageJ软件确定。结果用平均值表示 ± 扫描电镜(n个 = 3).^**P（P）* < 0.05与正常组，以及^#*P（P）* < 0.05 vs.Hypo组。**c（c）**Western blot分析缺氧条件下NAC诱导的HaCaT细胞BNIP3和LC3的表达以及p38/MAPK和JNK/MAPK的活性。HIF-1α被用作缺氧的指标。GAPDH被用作负荷控制。BNIP3的免疫染色(d日)和LC3(**e（电子）**)在指定的HaCaT细胞中。细胞核用DAPI染色。比例尺 = 25 微米。**f–h**使用指定的细胞进行伤口愈合试验和单细胞运动试验。伤口愈合的典型图像，包括角质形成细胞轨迹。比例尺 = 100 微米。定量分析的结果用平均值表示 ± 扫描电镜(n个 = 3).^**P（P）* < 0.05与正常组，以及^#*P（P）* < 0.05相对于Hypo组

**图6。缺氧条件下，BNIP3的表达受p38和JNK的调节。**
一HaCaT细胞暴露于低氧（2%）并孵育指定时间，采集总蛋白检测BNIP3的表达以及p38/MAPK和JNK/MAPK的活性。HIF-1α被用作缺氧指标。GAPDH被用作负荷控制。**b–e类**HaCaT细胞暴露于缺氧（2%）6 h.SB203580（SB，5 μM）和SP600125（SP，5 μM）添加MAPK抑制剂1 缺氧暴露前h。b条然后用所示抗体对提取的蛋白质进行免疫印迹。HIF-1α被用作缺氧指标。GAPDH被用作负荷控制。BNIP3的荧光染色(**c（c）**)、和LC3表达式(d日)图中显示了HaCaT细胞。细胞核用DAPI染色。比例尺 = 25 微米。**e（电子）**伤口愈合分析和**（f）**使用指示的细胞进行单细胞运动分析。伤口愈合的典型图像，包括角质形成细胞轨迹。比例尺 = 100 微米。定量分析的结果(克)用平均值表示 ± 扫描电镜(n个 = 3).^**P（P）* < 0.05与正常组，以及^#*P（P）* < 0.05与Hypo组

**图7。说明BNIP3通过自噬激活促进角质形成细胞迁移的示意图。**
伤口边缘的创伤诱导缺氧刺激ROS的积累，进而增加p38和JNK-MAP激酶的磷酸化。活化的MAP激酶促进转录因子（TF）信号传导的上调，如HIF-1α和FOXO，提高BNIP3的表达，并导致自噬的诱导。此外，角质形成细胞的迁移需要自噬

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1. 郭S，Dipietro LA。影响伤口愈合的因素。《牙科杂志》。2010年决议；89:219–229. doi:10.1177/0022034509359125。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
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