Isolation and characterization of myogenic precursor cells from human cremaster muscle

doi:10.1038/s41598-019-40042-6

.2019年3月5日；9(1):3454.

doi:10.1038/s41598-019-40042-6。

人提睾肌肌源性前体细胞的分离与鉴定

附属公司

¹西班牙圣塞巴斯蒂安生物技术研究所组织工程组。
²西班牙圣塞巴斯蒂安生物技术研究所神经肌肉疾病组。
^三西班牙马德里卡洛斯三世研究所生物研究中心（CIBERNED）。
⁴西班牙圣塞巴斯蒂安，维拉金病媒核心。
⁵西班牙马拉加马拉加生物医学研究所（IBIMA）CNIO-IBIMA泌尿生殖肿瘤研究室。
⁶西班牙马拉加维多利亚大学医院泌尿科。
⁷西班牙圣塞巴斯蒂安UPV-EHU医学和牙科学院神经科学系。
⁸西班牙圣塞巴斯蒂安多诺斯蒂亚大学医院神经病学系。
⁹西班牙马拉加维多利亚大学医院外科。
¹⁰西班牙萨拉戈萨阿拉贡卫生研究所。
¹¹西班牙马德里卡洛斯三世研究所生物研究中心（CIBEREHD）。
¹²吉梅内斯·迪亚斯基金会健康研究所（IIS FJD），西班牙马德里。
¹³西班牙马德里卡洛斯三世大学生物医学与航空航天工程系。
¹⁴数字产业，产品设计，IDONIAL技术中心，吉翁，西班牙。
¹⁵西班牙马拉加马拉加生物医学研究所（IBIMA）CNIO-IBIMA泌尿生殖肿瘤研究室。mf.lara@fimabis.org。
¹⁶西班牙马拉加维多利亚大学医院泌尿科。mf.lara@fimabis.org。
¹⁷西班牙圣塞巴斯蒂安生物技术研究所组织工程组。ander.izeta@biodonostia.org。
¹⁸西班牙圣塞巴斯蒂安纳瓦拉Tecnun-University工程学院生物医学工程与科学系。ander.izeta@biodonostia.org。

PMID： 30837559
预防性维修识别码： PMC6401155型
内政部： 10.1038/s41598-019-40042-6

人提睾肌肌源性前体细胞的分离与鉴定

内亚·纳尔达兹·加斯西（Neia Naldaiz-Gastesi）等。科学代表. 2019.

.2019年3月5日；9(1):3454.

doi:10.1038/s41598-019-40042-6。

附属公司

¹西班牙圣塞巴斯蒂安生物技术研究所组织工程组。
²西班牙圣塞巴斯蒂安生物研究所神经肌肉疾病组。
^三西班牙马德里卡洛斯三世研究所生物研究中心（CIBERNED）。
⁴西班牙圣塞巴斯蒂安，维拉金病媒核心。
⁵西班牙马拉加马拉加生物医学研究所（IBIMA）CNIO-IBIMA泌尿生殖肿瘤研究室。
⁶西班牙马拉加维多利亚大学医院泌尿外科。
⁷西班牙圣塞巴斯蒂安UPV-EHU医学和牙科学院神经科学系。
⁸西班牙圣塞巴斯蒂安大学医院神经内科。
⁹西班牙马拉加维多利亚大学医院外科。
¹⁰西班牙萨拉戈萨阿拉贡卫生研究所。
¹¹西班牙马德里卡洛斯三世研究所生物研究中心（CIBEREHD）。
¹²吉梅内斯·迪亚斯基金会健康研究所（IIS FJD），西班牙马德里。
¹³西班牙马德里卡洛斯三世大学生物医学与航空航天工程系。
¹⁴数字产业，产品设计，IDONIAL技术中心，吉翁，西班牙。
¹⁵西班牙马拉加马拉加生物医学研究所（IBIMA）CNIO-IBIMA泌尿生殖肿瘤研究室。mf.lara@fimabis.org。
¹⁶西班牙马拉加维多利亚大学医院泌尿科。mf.lara@fimabis.org。
¹⁷西班牙圣塞巴斯蒂安生物技术研究所组织工程组。ander.izeta@biodonostia.org。
¹⁸西班牙圣塞巴斯蒂安纳瓦拉Tecnun-University工程学院生物医学工程与科学系。ander.izeta@biodonostia.org。

PMID： 30837559
预防性维修识别码： PMC6401155型
内政部： 10.1038/s41598-019-40042-6

摘要

人类肌源性前体细胞已经从许多骨骼肌中分离并扩增出来，但在肌肉损伤广泛的疾病中，必须寻找其他供者活检部位。活检点必须相对容易到达，并且活检肌肉是不必要的。在这里，我们的目的是从组织学的角度，从卫星细胞和再生纤维的数量方面，对火葬长肌肉进行表征，并分离和表征成年男性供体中的人类火葬长肌源性干/前体细胞，目的是将该肌肉表征为肌源性前体细胞的新来源。对接受泌尿生殖器官病理常规手术的男性患者进行肛门直肠肌活检（或阴性对照组的相邻非肌肉组织；N=19）。对肌球培养物进行了衍生，并对其体外和体内肌源性分化和肌肉再生能力进行了测试。肌层培养维持Cremaster衍生的肌原前体细胞，并在黏附培养中有效分化为肌管。在移植到心脏毒素诱导的急性肌肉损伤的免疫受损小鼠模型后，人类乳糜母源性肌原前体细胞存活到移植中，并有助于肌肉再生。这些前体是骨骼肌细胞治疗方法的良好候选。由于它们的位置和发育起源，我们认为它们可能最适合于前列腺癌根治术后压力性尿失禁患者的横纹肌括约肌再生。

PubMed免责声明

利益冲突声明

本手稿中显示的研究由西班牙专利申请号P201830244涵盖，该申请由Servicio Andaluz de Salud和Administración General de la Comunidad Autónoma de Euskadi共同拥有。AI、ALM、NN-G、MG、BH-I、MFL和IMA被列为发明人。

数字

图1
人类托儿所肌肉的组织学特征。(A类–C类)用H&E染色的火葬长肌肉组织切片，可以看到详细的纤维形态(A类,B类)并强调了具有中心核的再生纤维的存在(C类,D类)三次独立活检中定量的中央有核纤维百分比。蓝线表示数据的中值。比例尺，100 微米。

图2
人类长肌中慢型纤维的优势。(A类,B类)通过免疫荧光分析肌肉切片，显示MYHC在纤维中的表达（所有异构体，绿色）和纤维周围的层粘连蛋白表达（红色）。(C类,D类)通过免疫荧光分析肌球蛋白重链亚型表达研究纤维类型优势(C类,E类,F类)以及由此产生的不同纤维定量图，显示了从三次独立活检中获得的中值和标准偏差(D类). 在A、B、C、E和F面板中，层压板以红色显示，细胞核用Hoechst 33258（蓝色）进行复染。比例尺，100 微米。

图3
人类提睾肌中的卫星细胞和再生纤维。(A类,B类)免疫荧光检测到的MYH3（胚胎肌球蛋白亚型）表达纤维的百分比（绿色），被层粘连蛋白包围（红色）。箭头在(A类)显示再生纤维和图表(B类)显示再生纤维占总纤维的百分比，这在三次独立的活检中进行了量化。蓝线表示数据的中值。(C类,D类)PAX7+卫星细胞（绿色）的免疫荧光检测位于两层LAMININ阳性层（红色）之间的壁龛中。箭头在(C类)指向一个卫星小区。(D类)三次独立活检中PAX7阳性细胞核的定量百分比。蓝线表示数据的中值。细胞核用Hoechst 33258（蓝色）复染。比例尺，100 微米。

图4
体外人提睾肌源性肌源性前体细胞的分离、扩增和分化。(A类)男性生殖系统解剖示意图，显示了托马斯特肌肉（红色），活检样本区以矩形突出显示。肌球悬浮培养和肌管分化（粘附培养）步骤概述。(B类,C类)悬浮培养的光学显微镜图像显示第0天的细胞和组织碎片（箭头）(B类)和第7天的球体(C类). (D类–F类)第2天粘附培养的光学显微镜图像(D类)和第9天(E类,F类)其中多核肌管（箭头）占主导地位。比例尺，100 微米。

图5
肌源性、内皮性和间充质标志物在*在体外*人类提睾肌源性肌源性前体细胞的扩增。(A类–C类)d7肌源性蛋白表达的免疫荧光分析(A类,B类)和d15培养的肌球(C类). 箭头指示PAX7阳性的细胞（绿色，A类)和MYGENIN（绿色，B类). 共聚焦显微镜图像显示PAX7阳性细胞（绿色，C类). (D类)三次独立活检中几个球体中卫星细胞（PAX7阳性细胞）的定量百分比。蓝线表示数据的中值。(E类–J型)免疫荧光分析d15培养球的系列共聚焦显微镜图像，检测内皮细胞标记物CD31(E类–克)和间充质细胞标记物CD90(**H（H）**–J型). 细胞核用Hoechst 33258（蓝色）复染。比例尺，100 微米(A类,B类)和50 微米(C类,E类–J型).

图6
肌源性蛋白的表达*在体外*人类提睾肌源性肌源性前体细胞的分化。对d9-粘附培养物中肌源蛋白表达的免疫荧光分析显示PAX7阳性细胞（绿色，A类)和MYHC（所有亚型）阳性肌管（绿色，C类–D类). 箭头表示肉质条纹。(C类)三次独立活检中PAX7阳性细胞核的定量百分比。蓝线表示数据的中值。细胞核用Hoechst 33258（蓝色）复染。比例尺，100 微米。

图7
肌源性基因的表达*在体外*qRT-PCR法对人类提睾肌源性肌源性前体细胞的分化。在d9-分化培养中，肌原基因的表达*PAX7*(A类)，*第五个多年电价*(B类)，*MYOD1年*(C类)，*肌球蛋白*(D类)，*3令吉*(E类)和*MYH2年*(F类)通过qRT-PCR定量。三个独立的托儿所肌肉活检和非残留活检的表达值与内源性控制mRNA有关*TBP（待定）*。蓝线表示数据的中值。

图8
体内人类提睾肌源性肌源性前体细胞的分化。(A类)实验设计大纲。(B类–**H（H）**)对照TA组组织切片的免疫荧光(B类,D类,克)和实验性TA组(C类,F类,**H（H）**)分别是。(B类,C类)通过免疫荧光（绿色）检测人类层粘连蛋白A/C，对移植细胞存活进行组织学分析。(D类–F类)通过免疫荧光检测定位于其生态位的人类层蛋白A/C（绿色）和PAX7（红色）表达卫星细胞（箭头，E类). (克,**H（H）**)检测人类层蛋白A/C（绿色）和人类肌萎缩蛋白（红色）阳性纤维。细胞核用Hoechst 33258（蓝色）复染。比例尺，100 微米。

图9
体内人类灵长肌源性肌源性前体细胞的再生能力。(A类)在每只小鼠（N = 6). (B类)在每只小鼠中检测到的卫星细胞（PAX7阳性细胞）相对于人类细胞核总数的百分比。(C类)定量每只小鼠的人类DYSTROPHIN+纤维数量。数据的中位数和标准偏差分别用蓝线和黑线表示。

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1. 骨骼肌纤维的Mauro A.卫星细胞。生物物理和生物化学细胞学杂志。1961;9:493–495. doi:10.1083/jcb.9.2.493。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
1. Chal J，Pourquie O.制造肌肉：体内外骨骼肌生成。发展。2017;144:2104–2122。doi:10.1242/dev.151035。-DOI程序-公共医学
1. Tucciarone，L.等人。研究纤维脂肪原祖细胞和肌肉干细胞之间相互作用的先进方法。《Duchenne肌营养不良：方法和协议》（编辑：Bernardini，C.）231-256（Springer New York，2018）。-公共医学
1. Alexander MS等。CD82是人类肌肉卫星细胞前瞻性分离的标记物，与肌肉营养不良有关。细胞干细胞。2016;19:800–807. doi:10.1016/j.stem.2016.08.006。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
1. Bareja A等。人类和小鼠骨骼肌干细胞：肌发生的聚合和分化机制。公共科学图书馆一号。2014;9:e90398。doi:10.1371/journal.pone.0090398。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学

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[2] 骨骼肌纤维的Mauro A.卫星细胞。生物物理和生物化学细胞学杂志。1961;9:493–495. doi:10.1083/jcb.9.2.493。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学

[3] Chal J，Pourquie O.制造肌肉：体内外骨骼肌生成。发展。2017;144:2104–2122。doi:10.1242/dev.151035。-DOI程序-公共医学

[4] Chal J，Pourquie O.制造肌肉：体内外骨骼肌生成。发展。2017;144:2104–2122。doi:10.1242/dev.151035。-DOI程序-公共医学

[5] Tucciarone，L.等人。研究纤维脂肪原祖细胞和肌肉干细胞之间相互作用的先进方法。《Duchenne肌营养不良：方法和协议》（编辑：Bernardini，C.）231-256（Springer New York，2018）。-公共医学

[6] Tucciarone，L.等人。研究纤维脂肪原祖细胞和肌肉干细胞之间相互作用的先进方法。《Duchenne肌营养不良：方法和协议》（编辑：Bernardini，C.）231-256（Springer New York，2018）。-公共医学

[7] Alexander MS等。CD82是人类肌肉卫星细胞前瞻性分离的标记物，与肌肉营养不良有关。细胞干细胞。2016;19:800–807. doi:10.1016/j.stem.2016.08.006。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Alexander MS等。CD82是人类肌肉卫星细胞前瞻性分离的标记物，与肌肉营养不良有关。细胞干细胞。2016;19:800–807. doi:10.1016/j.stem.2016.08.006。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Bareja A等。人类和小鼠骨骼肌干细胞：肌发生的聚合和分化机制。公共科学图书馆一号。2014;9:e90398。doi:10.1371/journal.pone.0090398。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Bareja A等。人类和小鼠骨骼肌干细胞：肌发生的聚合和分化机制。公共科学图书馆一号。2014;9:e90398。doi:10.1371/journal.pone.0090398。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学

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