Cardiac hypertrophy and arrhythmia in mice induced by a mutation in ryanodine receptor 2

doi:10.1172/jci.insight.126544

.2019年3月5日；5（7）：e126544。

doi:10.11172/jci.insight.126544。

ryanodine受体2突变诱导小鼠心脏肥大和心律失常

附属公司

¹美国威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学麦迪逊医学与公共卫生学院心血管医学部和心血管研究中心医学系。
²儿科和青少年医学部，儿科心脏病学部，和。
^三美国明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所温德兰-史密斯-莱斯猝死基因组实验室分子药理学和实验治疗学系。
⁴天津大学药物科学与技术学院化学科学与工程协同创新中心天津现代给药与高效重点实验室，中国天津。
⁵美国威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学麦迪逊医学院儿科。
⁶药理学和。
⁷美国密歇根州安阿伯市密歇根大学内科。
⁸加拿大不列颠哥伦比亚大学生物化学和分子生物学系，温哥华。
⁹美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所心律服务部心血管医学部。。

PMID： 30835254
预防性维修识别码： PMC6483635型
内政部： 10.1172/jci.insight.126544

ryanodine受体2突变诱导小鼠心脏肥大和心律失常

弗朗西斯科·阿尔瓦拉多等。 JCI洞察力. 2019.

.2019年3月5日；5（7）：e126544。

doi:10.1172/jci.insight.126544。

附属公司

¹美国威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学麦迪逊医学与公共卫生学院心血管医学系和心血管研究中心。
²儿科和青少年医学部，儿科心脏病学部，和。
^三美国明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所温德兰-史密斯-莱斯猝死基因组实验室分子药理学和实验治疗学系。
⁴天津大学药物科学与技术学院化学科学与工程协同创新中心天津现代药物传递与高效重点实验室，天津，中国。
⁵美国威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学麦迪逊医学院儿科。
⁶药理学系和。
⁷美国密歇根州安阿伯市密歇根大学内科。
⁸加拿大不列颠哥伦比亚大学生物化学和分子生物学系，温哥华。
⁹美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所心律服务部心血管内科。。

PMID： 30835254
预防性维修识别码： PMC6483635型
内政部： 10.1172/jci.insight.126544

摘要

肥厚型心肌病（HCM）主要是由编码肌聚蛋白的基因突变触发的，但有很大一部分患者缺乏基因诊断。我们在一名来自基因型阴性HCM队列的患者中发现了赖氨酸定受体2 RyR2-P1124L的新突变。本研究的目的是确定RyR2-P1124L是否触发了隔离RyR2通道和整个心脏的功能和结构改变。我们发现P1124L在RyR2的SPRY2结构域中诱导了显著的构象变化。重组RyR2-P1124L通道显示细胞溶质功能丧失表型，与之相比，对管腔[Ca2+]的敏感性更高，表明管腔获得功能。RyR2-P1124L纯合小鼠表现出轻度心肌肥厚，与人类患者相似。这种表型在1岁时表现明显，伴随着钙调蛋白（CaM）表达的增加。P1124L小鼠在8个月龄肥大开始前也表现出较高的心律失常敏感性。RyR2-P1124L具有明显的细胞溶质功能丧失和管腔获得功能表型。这种双功能过度行为引发心律失常和心脏结构重塑，并涉及钙调蛋白作为潜在的肥大介质的过度表达。这项研究与继续阐明基因型阴性HCM的可能原因以及RyR2在心肌肥厚中的作用有关。

关键词：钙；心脏病学；心血管疾病；励磁-收缩耦合。

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利益冲突：MJA是Audentes Therapeutics、Boston Scientific、Gilead Sciences、Invitae、Medtronic、MyoKardia和St.Jude Medical的顾问。MJA和梅奥诊所与Alive Cor、Blue Ox Health和StemoniX有股权/特许权使用关系，但迄今为止没有报酬。

数字

**图1。P1124L在RyR2中的位置和SPRY2畴的晶体结构。**
(A类)单个ryanodine受体2（RyR2）亚单位的线性表示，表示CPVT突变聚集的区域（CPVT-I至-IV）。3个SPRY域在所有面板中都有指示和彩色编码。(B类)来自5个相关物种的SPRY2 RyR2区域的氨基酸序列。突出显示了与人类1107和1124相对应的残留物。补充图2显示了加入数量以及其他物种和亚型。(C类)文献中RyR2的电子密度图（20）。子单位由黑线分隔。(天)RyR2的3个SPRY域之间的模拟接口。显示了2个HCM相关突变A1107和P1124的位置。(E类和F类)分别从文献（19）和本工作中获得的WT和P1124L SPRY2畴的叠加晶体结构。星号表示β2-β3连接子内残基1124的位置。蓝色箭头表示4个残基在WT和P1124L结构之间移动。红色虚线表示盐桥。

**图2。RyR2-P1124L的分子表型。**
(A类)钙²⁺-从属的[^三H] 瑞尼定受体2（RyR2）表达校正的瑞尼定结合曲线。老鼠*莱尔2*cDNA瞬时转染HEK293细胞。转染48小时后细胞被裂解。然后将重组RyR2与[^三H] 在[Ca浓度增加的情况下的ryanodine²⁺]激活频道。[^三H] ryanodine用液体闪烁法测定。(B类)最大结合力（B_马克斯)使用希尔方程从A中的曲线计算得出。(C类)钙²⁺-从属的[^三H] ryanodine结合曲线（与A类)归一化为10μM[Ca²⁺]. (天)欧盟委员会₅₀对于[Ca²⁺]-从属的[^三H] 赖氨酸结合(**A–D**,n个=至少4个独立转染的7条曲线**P（P）*< 0.05, ***P（P）*<0.01，秩和检验）。(E类)从心脏微粒体制备的WT和纯合（纯合子）P1124L心脏的代表性单RyR2通道记录。通道融合成人工平面脂质双层。单通道电流和开路概率（P_{O（运行）})在名义自由[钙²⁺]在300/50 mM的Cs中⁺梯度。(F类)从2个代表通道计算的标准化电流的重叠直方图。(**G公司**)平均P_{O（运行）}WT和P1124L通道。(**H（H）**)根据300/50 mM Cs记录计算的平均单通道电流⁺梯度(**G公司**和**H（H）**,n个=3个WT，5–6个P1124L通道**P（P）*<0.05，双尾t吨测试）。

**图3。自发钙异常终止²⁺在表达RyR2的HEK293细胞中释放。**
(A类)使用内-ER Ca的内-ER FRET信号的代表性迹线²⁺表达RyR2的细胞中的传感器D1ER。用D1ER转染小鼠RyR2可诱导表达的稳定HEK293细胞。转染18–24小时后，用1μg/ml四环素诱导RyR2表达。在RyR2诱导18–24小时后进行D1ER FRET的时间推移成像。在0[Ca采集图像3分钟²⁺]，在1 mM[Ca下3分钟²⁺]，2 mM[Ca下5分钟²⁺]，在1 mM四环素存在下5分钟，以抑制RyR2并测量最大ER Ca²⁺容量（F_马克斯)，在20 mM咖啡因存在下约3分钟，排空ER并测量剩余FRET信号（F_分钟). (**B–D类**)激活(B类)和终止(C类)ER-Ca的阈值和分数²⁺发布的内容(天)在自发振荡期间(**P（P）*< 0.05, ***P（P）*<0.01，秩和检验[B类]，双尾t吨测试[**C–D类**]). (E类)ER存储容量确定为（F_马克斯–F_分钟)并表示为WT的百分比（秩和检验）。(F类)存储中显示振荡的细胞百分比[Ca²⁺]（z测试）。(**G公司**)[Ca的平均数量²⁺]每个电池的振荡(***P（P）*<0.01，秩和检验）(n个=40[**B–D类**], 49 [E类], 87 [F类]、和39[**G公司**]WT细胞；44个[**B–D类**], 61 [E类], 104 [F类]和43[**G公司**]来自4个独立D1ER转染和RyR2表达诱导的P1124L细胞）。

**图4。1岁P1124L小鼠的心脏肥大。**
(A类)福尔马林固定心脏的代表性图像（第一排比例尺：5mm）、FFPE组织低倍H&E染色冠状切片（第二排比例规：5mm），H&E着色组织切片的显微照片（第三排比例栏：200μm），以及Masson三色染色组织切片的微观照片（第四排比例杠：200μm）。图像代表了n个=每个基因型3个心脏。(**B–D类**)后壁M型超声心动图测量(B类)和隔板厚度(C类)以及射血分数(天). 在记录过程中，用异氟醚对小鼠进行轻度麻醉。(E类)心脏重量占总体重的百分比(n个=8只WT、7只Het、8只Homo小鼠**P（P）*<0.05，秩的方差分析（B组），单向方差分析（C-E组）。

**图5。1岁P1124L小鼠心肌细胞的细胞肥大。**
(A类)心室肌细胞的典型透射光图像（比例尺：50μm）。用酶法从新鲜移植的心脏中分离出心肌细胞。使用共焦显微镜获得图像。单元格被描绘成绿色（测量的单元格）或紫色（焦点外或帧外）。(**B–D类**)单元格宽度(B类)，长度(C类)、和表面积(天)从透射光图像测量（左,单个测量值n个=75 WT，81 Het，84 Homo细胞；对，的平均值n个=每个基因型3个心脏**P（P）*<0.05，单因素方差分析）。(E类)方框图显示3个肥大基因的转录表达水平：利钠肽A(*Nppa公司*)，钠尿肽B(*无购买力平价*)和肌球蛋白重链7(*我的7*). 数据标准化为肌动蛋白(*法案b）*表达式(n个=每个基因型5个WT，4个Het，5个Homo心脏***P（P）*< 0.01, ***P（P）*<0.05，单因素方差分析）。

**图6。RyR2和钙调蛋白在P1124L心脏中的表达。**
(A类)3–6个月龄和1岁以上小鼠心脏匀浆中ryanodine受体2（RyR2）和钙调蛋白（CaM）表达的典型Western blots。带强度归一化为来自同一凝胶的GAPDH信号。显示了不同凝胶中蛋白质的单独负载控制（GAPDH）。(B类)RyR2表达的量化（单向方差分析[3-6个月]或等级方差分析[1年]）。(C类)CaM表达的量化(n个=10 WT，8[3–6个月]和9[1岁]Het，每个年龄组10个人类心脏**P（P）*<0.05，秩间方差分析）。

**图7。对自发钙的敏感性²⁺1岁小鼠心室肌细胞释放。**
(A类)用300 nM异丙肾上腺素（Iso）刺激WT和人心室肌细胞的代表性痕迹，以3 Hz的频率起搏30秒，并在休息时监测30秒。酶分离心肌细胞负载荧光钙²⁺指示灯fluo-4 AM和所示的场刺激。使用共焦显微镜记录线扫描图像。(B类)显示自发Ca的细胞百分比²⁺释放事件（SCR，定义为Ca²⁺波浪）。在基础条件下，同源小鼠SCR发病率增加(n个=每个基因型3个心脏**P（P）*<0.05，单因素方差分析）。(C类)3 Hz刺激序列后30秒内监测的SCR事件的平均数量（左，来自n个=17 WT，16 Het，16 Homo基底细胞和12 WT，14 Het，23 Homo等刺激细胞；右，的平均值n个=每个基因型3个心脏**P（P）*<0.05，单因素方差分析）。

**图8。8个月大时用肾上腺素/咖啡因激发的P1124L小鼠对室性心律失常的敏感性。**
(A类)接受心律失常挑战的小鼠的两秒钟代表性导联II ECG描记。用异氟醚麻醉小鼠，并监测基础心电图10–15分钟。在腹腔注射肾上腺素（2 mg/kg）和咖啡因（120 mg/kg）（Epi/Caff）后，进一步监测心电图30分钟。从上到下，这些痕迹表明窦性心律；室性早搏；非持续性心室二联律；和双向室性心动过速（BDVT）。(B类——天)在接受心律失常激发的小鼠中，室性早搏的平均次数和非持续性（持续≤5秒）和持续性心律失常（持续>5秒）的发作次数。(E类)持续BDVT的发生率，定义为具有交替去极化轴的异位搏动(n个=每个基因型7只小鼠**P（P）*<0.05 vs.WT，ANOVA等级[**B–C类**]，单因素方差分析[天]，z测试[E类]).

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