The SIAH2-NRF1 axis spatially regulates tumor microenvironment remodeling for tumor progression

doi:10.1038/s41467-019-08618-y

.2019年3月4日；10(1):1034.

doi:10.1038/s41467-019-08618-y。

SIAH2-NRF1轴空间调控肿瘤微环境重塑促进肿瘤进展

彪马¹, 洪城城², 穆成龙², 耿广丰², 田昭², 钱罗², 凯里马², 瑞昌（Rui Chang）², 刘强强², 高瑞泽², 聂俊丽², 谢佳莹², 韩进雪², 陈林波², 桂玛², 朱玉山³, 全晨^4 5

附属公司

¹南开大学生命科学学院蛋白质科学天津重点实验室，药物化学生物学国家重点实验室，天津，300071，中国。biaoma@mail.nankai.edu.cn。
²南开大学生命科学学院蛋白质科学天津重点实验室，药物化学生物学国家重点实验室，天津，300071，中国。
³南开大学生命科学学院蛋白质科学天津重点实验室，药物化学生物学国家重点实验室，天津，300071，中国。zhuys@nankai.edu.cn。
⁴南开大学生命科学学院蛋白质科学天津重点实验室，药物化学生物学国家重点实验室，天津，300071，中国。chenq@ioz.ac.cn。
⁵中国科学院动物研究所膜生物学国家重点实验室，北京，100101。chenq@ioz.ac.cn。

PMID： 30833558
预防性维修识别码： PMC6399320型
内政部： 10.1038/s41467-019-08618年

SIAH2-NRF1轴空间调控肿瘤微环境重塑促进肿瘤进展

彪马等。国家公社. 2019.

.2019年3月4日；10（1）:1034。

doi:10.1038/s41467-019-08618-y。

作者

彪马¹, 洪城城², 穆成龙², 耿光丰², 田昭², 钱罗², 凯里马², 瑞昌², 刘强强², 高瑞泽², 聂俊丽², 谢嘉英², 韩进雪², 陈林波², 桂玛², 朱玉山³, 全晨^4 5

附属公司

¹南开大学生命科学学院蛋白质科学天津重点实验室，药物化学生物学国家重点实验室，天津，300071，中国。biaoma@mail.nankai.edu.cn。
²南开大学生命科学学院蛋白质科学天津重点实验室，药物化学生物学国家重点实验室，天津，300071，中国。
³南开大学生命科学学院蛋白质科学天津重点实验室，药物化学生物学国家重点实验室，天津，300071，中国。zhuys@nankai.edu.cn。
⁴南开大学生命科学学院蛋白质科学天津重点实验室，药物化学生物学国家重点实验室，天津，300071，中国。chenq@ioz.ac.cn。
⁵中国科学院动物研究所膜生物学国家重点实验室，北京，100101。chenq@ioz.ac.cn。

PMID： 30833558
预防性维修识别码： PMC6399320型
内政部： 10.1038/s41467-019-08618年

摘要

肿瘤细胞与其微环境的相互作用，包括缺氧、酸中毒和免疫细胞，导致肿瘤异质性，从而促进肿瘤的进展。在这里，我们表明SIAH2-NRF1轴通过调节肿瘤线粒体功能、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）极化和细胞死亡来重塑肿瘤微环境，从而维持和发展肿瘤。从机制上讲，乳腺癌中线粒体基因的低表达与临床预后不良有关。缺氧激活的E3连接酶SIAH2通过赖氨酸230上的泛素化降解NRF1（核呼吸因子1），在空间上下调核编码的线粒体基因表达，包括丙酮酸脱氢酶β，从而增强Warburg效应、代谢重编程和促肿瘤免疫反应。低氧条件下抑制NRF1降解不仅会损害TAM的极化，而且会促进肿瘤细胞更容易以FADD依赖的方式发生凋亡，从而导致因胞吐障碍导致的继发性坏死。这些数据表明，抑制NRF1降解是一种潜在的癌症治疗策略。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
核编码线粒体基因表达与乳腺癌患者的临床结局负相关。一来自数据集的正常和乳腺癌组织中GO（基因本体）富集分析GSE15852标准，错误发现率（FDR）<25%。b条上图：代表性正常乳腺组织样本和来自组织芯片的乳腺癌组织样本中的Probitin免疫组织化学染色。比例尺，50 微米。棕色表示免疫反应阳性。底部：图中显示了27个正常组织和158个肿瘤组织样本中的Probitin染色强度。统计显著性由以下因素决定χ²测试。**c（c）**,d日Probitin染色强度与临床T分期相关性的统计分析(**c（c）**)或临床AJCC阶段(d日). 统计显著性由以下因素决定χ²测试。**e（电子）**乳腺癌患者无复发生存率（DRFS）与指示基因表达的相关性分析GSE25055标准.（f）用抗GLUT1（红色）和抗TIMM23（绿色）抗体以及DAPI（蓝色）对小鼠自发乳腺肿瘤组织进行染色。比例尺，50 微米。克常氧和缺氧培养的MDA-MB-231细胞线粒体基因表达的热图（数据集第18494页).小时乳腺癌患者线粒体基因DRFS与GO富集的相关性分析GSE25055标准

图2
低氧转录通过NRF1调节核编码线粒体基因表达。一,b条使用所示抗体通过免疫印迹法测定蛋白质水平的分析(一)和mRNA水平，通过所示基因的实时PCR（qRT-PCR）测定(b条)，在缺氧培养的MDA-MB-231细胞中的指示时间点。qRT-PCR结果归一化为看家基因*企业对企业*.详细的统计数据(一)如补充图1a所示。**c（c）**MDA-MB-231细胞用25 微克毫升⁻¹环己酰亚胺（CHX）用于2 h，然后在缺氧条件下培养指定的时间点。收集细胞并使用所示抗体进行免疫印迹分析。详细统计数据如补充图2b所示。d日稳定*NRF1级*-在指定的时间点，使用指定的抗体通过免疫印迹分析低氧培养的敲除MDA-MB-231细胞。详细统计数据如补充图2c所示。**e（电子）** *NRF1级*将siRNA转染到指定的细胞系并在缺氧条件下培养36 然后用所示抗体通过免疫印迹分析h和细胞裂解物。对于所有面板，错误条指示s.d。，n个 = 3个生物重复，平均n个 = 每个生物复制品使用3个技术复制品(b条). 使用单向方差分析比较数据

图3
SIAH2促进NRF1在缺氧条件下的多泛素化和降解。一低氧介导的NRF1降解被蛋白酶体抑制剂MG132抑制，但不被自噬抑制剂Bafilomycin A1（BafA1）抑制。右：NRF1表达的密度定量。b条MDA-MB-231细胞在常氧或缺氧条件下培养24小时 h.用10 用于6的µM MG132 收割前h。用抗NRF1抗体免疫沉淀细胞裂解物，然后用抗NRF1和抗泛素抗体通过蛋白质印迹进行检测。**c（c）**低氧相关泛素E3连接酶与Myc-NRF1瞬时共转染HeLa细胞24小时 h、用抗Myc抗体免疫印迹法检测Myc-NRF1蛋白水平。d日体外细菌表达的His-NRF1和GST-SIAH2之间的直接相互作用。**e（电子）**SIAH2的异位表达，但不是SIAH2^{马来西亚令吉}体内NRF1泛素化增加。**（f）**纯化SIAH2而非SIAH2对细菌表达的His-NRF1的泛素化^{马来西亚令吉}体外试验。克MDA-MB-231细胞在常氧或缺氧条件下培养18小时 h、然后用10 µM MG132，并在常氧或缺氧条件下再孵育6 h.通过免疫沉淀分析NRF1和SIAH2之间的内源性相互作用。小时野生型或*SIAH2号机组*^−/−用打乱或NRF1靶向siRNA瞬时转染MDA-MB-231细胞，然后在常氧或缺氧条件下培养36小时 h.收集细胞并通过western blotting进行分析。底部：所示蛋白质的密度定量。我缺氧诱导的NRF1泛素化通过体内SIAH2的耗竭而被消除。j个上图：来自组织芯片的正常乳腺组织和乳腺癌组织中NRF1和SIAH2的代表性免疫组织化学染色。（棕色表示免疫反应阳性；刻度条，50 微米）。底部：热图显示正常乳腺组织和乳腺癌组织中NRF1和SIAH2蛋白表达的定量分析。n个 = 158个乳腺肿瘤和n个 = 27个正常乳房样本。免疫染色结果的统计分析见补充表3、4。对于所有面板，错误条指示s.d。，n个 = 3个生物复制。数据与双尾配对比率进行比较t吨-测试

图4
NRF1 Lys230负责SIAH2介导的NRF1在缺氧条件下的泛素化和降解。一NRF1赖氨酸230的测定是SIAH2诱导降解的原因。NRF1蛋白水平的量化如下所示。b条SIAH2以剂量依赖的方式诱导野生型NRF1降解，但对NRF1-K230R无影响。**c（c）**SIAH2诱导NRF1泛素化，但不诱导NRF1-K230R泛素化。d日纯化的SIAH2促进细菌表达的野生型NRF1的泛素化，但不促进NRF1-K230R的体外泛素化。**e（电子）**用SIAH2标记共免疫沉淀外源表达的Myc-NRF1或Myc-NRF1-K230R^{马来西亚令吉}.（f）体内表达NRF1-K230R突变体可消除NRF1低氧诱导的泛素化。克用野生型NRF1或NRF1-K230R瞬时转染HeLa细胞12 h、然后在常压或缺氧条件下再培养36个 h.收获细胞，并用指示的抗体通过免疫印迹进行分析。NRF1蛋白水平的量化如下所示。对于所有面板，错误条指示s.d。，n个 = 3个生物复制。数据与双尾配对比率进行比较t吨-测试

图5
SIAH2通过NRF1调节细胞核编码的线粒体基因表达。一野生型或*SIAH2号机组*^−/−MDA-MB-231细胞瞬时转染Scramb或*NRF1级*-靶向siRNA然后在常氧或缺氧条件下培养36 h.收集细胞并通过western blotting进行分析。底部：所示蛋白质的密度定量。b条来自按中处理的细胞的qRT-PCR数据的统计分析(一). qRT-PCR结果归一化为看家基因*企业对企业*.c（c）稳定*NRF1级*-敲除用野生型NRF1或NRF1-K230R突变重组的MDA-MB-231细胞，以及模拟和*NRF1级*-敲除MDA-MB-231细胞，在常氧或缺氧条件下培养36 h，免疫印迹分析。底部：所示蛋白质的密度定量。d日在中处理的单元格(**c（c）**)用qRT-PCR进行分析，并进行统计学比较。qRT-PCR结果归一化为看家基因*企业对企业*.e（电子）在缺氧条件下培养稳定表达K230R-NRF1的MDA-MB-231细胞，然后在指定的时间点使用指定的抗体进行免疫印迹分析。详细统计数据如补充图2d所示。对于所有面板，错误条指示s.d。，n个 = 3个生物重复，平均n个 = 每个生物复制品使用3个技术复制品(b条)和(d日). 双尾配对比率t吨-测试用于比较（a-d）中的数据，单向方差分析用于比较(**e（电子）**)

图6
SIAH2-NRF1轴促进缺氧诱导的代谢重编程。一–d日野生型，*SIAH2号机组*^−/−和*SIAH2号机组*^−/−/*NRF1级*siRNA MDA-MB-231细胞在常氧或缺氧条件下培养36 h、和细胞内前列腺素E2（PGE2）的浓度(一)，葡萄糖(b条)，乳酸(**c（c）**)在培养基和mRNA水平*PDHB公司*(d日)进行了分析。qRT-PCR结果标准化为持家基因*企业对企业*.e（电子）NRF1结合位点示意图*PDHB公司*ChIP分析中使用的基因和寡核苷酸。**（f）**用IgG和NRF1抗体进行ChIP检测，并用qRT-PCR分析指示基因。qRT-PCR结果归一化为输入。克–我将模拟处理或稳定表达野生型NRF1或NRF1-K230R突变的MDA-MB-231细胞在常氧或缺氧条件下培养36小时 h、以及前列腺素E2（PGE2）的浓度(克)，葡萄糖(小时)和乳酸(我)进行了分析。j个指示细胞在常氧或缺氧条件下培养36 h、细胞被100染色 nM壬基吖啶橙（NAO）并进行分析。k个野生型或K230R稳定表达的MDA-MB-231细胞在常氧或缺氧条件下培养36 h.收集细胞并用所示抗体进行western印迹分析。右：所示蛋白质的密度定量。我单元格来自(k个)收集并测量PDH活性。米SIAH2-NRF1轴调节低氧诱导的代谢重编程的拟议模型。对于所有面板，错误条指示s.d。，n个 = 3个生物重复，平均n个 = 每个生物复制品使用3个技术复制品(一–d日)(**（f）**–我)和(我). 双尾未婚学生t吨-测试用于(一–**c（c）**)和(**（f）**–我). 双尾配对比率t吨-测试用于(d日)和(k个–我)

图7
NRF1降解是肿瘤维持和TAM极化所必需的。一–**c（c）**图像(一)，增长曲线(b条)和重量(**c（c）**)来自MDA-MB-231细胞的异种移植瘤，并进行了相应的修饰。通过皮下注射细胞在小鼠体内建立肿瘤。d日,**e（电子）**苏木精-伊红染色法分析显示的异种移植瘤组织(d日)组织切片定量坏死面积(**e（电子）**). 比例尺，500 微米。**（f）**所示异种移植瘤组织用抗ARG1（红色）和抗TOMM20（绿色）抗体以及DAPI（蓝色）染色。比例尺，50 微米。克<3 使用来自DMEM或指示细胞条件培养基的KDa组分刺激骨髓来源的巨噬细胞。*ARG1公司*mRNA表达通过qRT-PCR分析并归一化为*ATCB公司*作为管家基因。小时用DAPI（蓝色）、抗ARG1（红色）和抗TIMM23（绿色）或抗GLUT1（红色）抗体对小鼠自发乳腺癌组织进行染色。比例尺，25 微米。对于所有面板，错误栏指示s.d.对于面板(一–**（f）**)和(小时),n个 = 每组5只小鼠。对于面板(克),n个 = 3个生物重复，平均n个 = 每个生物复制品使用3个技术复制品。双尾未婚学生t吨-测试用于比较数据

图8
NRF1的积累增强了FADD依赖的细胞凋亡，并损害了体内的传出细胞。一–**c（c）**所示异种移植瘤组织用抗IBA1（红色）和TUNEL（绿色）染色(一)和量化TUNEL + 凋亡细胞(b条)，和游离活性炭的比率：巨噬细胞相关活性炭(**c（c）**). 比例尺，25 微米。d日NRF1结合位点示意图*FADD公司*ChIP分析中使用的基因和寡核苷酸。**e（电子）**用IgG和NRF1抗体进行ChIP检测，并用qRT-PCR分析指示基因。qRT-PCR结果归一化为输入。**（f）**所示细胞在常氧或缺氧条件下培养36 h和*FADD公司*mRNA水平进行统计学分析。qRT-PCR结果归一化为看家基因*企业对企业*.克野生型或K230R稳定表达的MDA-MB-231细胞在常氧或缺氧条件下培养36 h.收集细胞并用抗FADD和抗ACTIN抗体进行免疫印迹分析。右：FADD蛋白质水平的密度定量。小时用抗FADD和抗ACTIN抗体进行western blotting分析三组来自指定异种移植瘤的新鲜冷冻组织。我将野生型或K230R稳定表达的MDA-MB-231细胞在常氧或缺氧条件下培养24小时 h，然后用50 纳克毫升⁻¹附加12的TRAIL h.收集细胞并用所示抗体进行western印迹分析。底部：裂解Caspase-3和裂解PARP1蛋白水平的密度定量。对于所有面板，错误栏指示s.d.对于面板(一–**c（c）**),n个 = 5只小鼠，平均n个 = 对每只小鼠5-10张图片进行统计分析。对于其他面板，n个 = 3个生物重复，平均n个 = 每个生物复制品使用3个技术复制品(**e（电子）**–**（f）**). 双尾未婚学生t吨-测试用于(b条–**c（c）**)和(**e（电子）**). 双尾配对比率t吨-测试用于(**（f）**–克)和(我)

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[2] Vyas S、Zaganjor E、Haigis MC。线粒体与癌症。细胞。2016;166:555–566. doi:10.1016/j.cell.2016.07.002。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[3] 华莱士特区。线粒体与癌症。Nat.Rev.癌症。2012;12:685–698. doi:10.1038/nrc3365。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[5] Warburg O。关于癌细胞的起源。科学。1956;123:309–314. doi:10.1126/science.123.3191.309。-内政部-公共医学

[6] Warburg O。关于癌细胞的起源。科学。1956;123:309–314. doi:10.1126/science.123.3191.309。-内政部-公共医学

[7] Woo DK等。线粒体基因组不稳定性和ROS增强APC（Min/+）小鼠的肠道肿瘤发生。美国病理学杂志。2012;180:24–31. doi:10.1016/j.ajpath.2011.10.003。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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