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.2019年3月：41:408-419。
doi:10.1016/j.ebiom.2019.02.041。 Epub 2019年2月27日。

靶向内质网氧化还原素-1α和蛋白二硫异构酶之间的功能相互作用抑制宫颈癌的进展

张怡妮 1, 陶莉 1, 张丽慧 1, 福根上官 2, 桂枝市 三, 吴勋 1, 亚翠 4, 喜娥王 1, 西王 1, 刘永章 2, 陆斌（Bin Lu） 2, 涛涛伟 1, Chih-Chen Wang先生 1, 王磊（Lei Wang） 5
附属公司

靶向内质网氧化还原酶-1α和蛋白二硫化物异构酶之间的功能相互作用抑制宫颈癌的进展

张怡妮等。 EBioMedicine公司. 2019年3月.

摘要

背景：内质网（ER）氧化还原素-1α（Ero1α）和蛋白质二硫异构酶（PDI）是氧化蛋白折叠的关键途径，在许多癌症中高度表达。然而，靶向Ero1α和PDI之间的功能相互作用是否可能成为癌症治疗的新途径尚不清楚。

方法：我们进行了伤口愈合测定、transwell迁移和侵袭测定以及异种移植物测定，以评估细胞迁移、侵袭和肿瘤发生；采用凝胶过滤色谱法、耗氧试验和细胞内折叠试验检测Ero1α-PDI相互作用和Ero1β氧化酶活性。

调查结果：在这里，我们报道Ero1α的高表达与宫颈癌的不良预后相关。ERO1A基因敲除通过下调H2O（运行）2-相关的上皮-间充质转化。我们确定Ero1α的保守缬氨酸（Val）101对Ero1 a-PDI复合物的形成和Ero1 a氧化酶的活性至关重要。Ero1α的Val101特别参与PDI催化结构域的识别。Val101突变导致ER降低、氧化蛋白折叠延迟和H降低2O（运行）2子宫颈癌细胞ER中的水平，并进一步损害细胞迁移、侵袭和肿瘤生长。

解释：我们的研究确定了Ero1α识别PDI的关键残基，这突出了氧化蛋白折叠在肿瘤发生中的分子机制，并通过靶向Ero1 a-PDI相互作用为癌症治疗提供了证据。基金：本研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、中国科学院青年创新促进会的支持。

关键词：宫颈癌；Ero1α；偏微分方程；蛋白质相互作用；氧化还原。

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数字

图1
图1
Ero1α在宫颈癌中的表达上调，恶性程度和预后较差。（a） western blotting检测宫颈肿瘤组织（T）和邻近正常宫颈组织（N）中Ero1α和PDI蛋白的相对表达。对15名患者的谱带强度进行量化并归一化为表达水平的平均值。N（黑色）和T（红色）之间的每个线段代表一个人*P（P） < 0.05（双尾，成对学生t吨-测试）。（b） 用Ero1α抗体对60例（A1～L4，每例3个样本）宫颈癌组织芯片和9例正常宫颈组织（L5～M15，每例三个样本）进行免疫组化。样本M16来自皮肤恶性黑色素瘤，作为阳性标记物。（c） 宫颈癌组织芯片中Ero1α表达的免疫组织化学染色强度的代表性图像。阴性、弱、中度和强染色图像分别来自（b）中的样品M1、H5、D1、G14。（d） Ero1α表达水平在（b）的四个恶性级别宫颈组织中的比例。（e） 根据TCGA数据库对172例CESC（宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌）患者的总生存率进行Kaplan-Meier分析，这些患者表达高水平（大于第三位）和低水平（低于第一位）的能源监管局1A（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的网络版。）
图2
图2
能源监管局1A敲除（KO）损害HeLa细胞的生长、迁移、侵袭和肿瘤发生。（a） 野生型（WT）和两个无性系（C10和C13）的生长曲线能源监管局1AKO电池。数据显示为平均值 ± 三个生物复制品的扫描电镜***P（P） < 0.001（双尾学生t吨-测试）。（b） WT和能源监管局1AKO电池。（c） 跨井迁移分析和（d）跨井侵入分析。对滤膜底面的迁移细胞进行计数，并将其归一化为WT。数据显示为平均值 ± 在两个技术复制品中进行的三个独立实验的SEM***P（P） < 0.001（双尾学生t吨-测试）。（e） WT和能源监管局1AKO（C10）电池。WT和能源监管局1A将KO细胞分别皮下注射到雌性BALB/c裸鼠的左右两侧。38–42岁异种移植瘤的图像 显示接种后第天，肿瘤重量显示为平均值 ± 十个生物复制品的扫描电镜*P（P） < 0.05（双尾，成对的学生t吨-测试）。（f） 肌动蛋白相关分子在WT和能源监管局1Awestern blotting分析KO-HeLa细胞。（g） H（H）2O（运行）2WT ER中的水平和能源监管局1AKO细胞通过488/405的荧光强度比测定 HyPer的nm激发急诊室探针，添加0.5后 5的mM DTT 最小值数据显示为平均值 ± 四个技术副本的SEM***P（P） < 0.001（双尾学生t吨-测试）。结果代表了两个独立的实验。
图3
图3
位于外活性位点控制环中的保守Val101对Ero1α的活性至关重要。（a） Ero1α活性形式半胱氨酸模式的示意图。半胱氨酸残基显示为白色（非催化性）、绿色（调节性）、黄色（外部活性位点）和橙色（内部活性位点）圆圈，编号为。Val101和Trp272分别显示为红色和蓝色三角形。指出了Ero1α活性位点与其底物PDI和还原型谷胱甘肽（GSH）之间的电子传递途径。DNAman对不同物种Ero1蛋白中包含外部活性位点的柔性环进行了多序列比对。相同的（100%）、高度保守的（75-99%）、半保守的（50-74%）和可变的（<50%）残基分别用红色、洋红、粉色和白色阴影表示。（b） 活性形式的结构叠加（青色，PDB：3AHQ公司)和非活性形式（淡色，PDB：3小时)人类Ero1α。活性形式中缺失的外部活性位点控制环以淡紫色虚线显示，Val101残留物为红色三角形。突出的β发夹中的Trp272显示为蓝色三角形。（c） Ero1α蛋白的Far-UV圆二色性分析。（d） 2催化耗氧量 μM Ero1α蛋白在20 μM PDI和10 mM谷胱甘肽。（e，f）PDI和Ero1α蛋白之间相互作用的凝胶过滤分析。Ero1α重量分别对单体、PDI单体及其1:1混合物进行了分析（e）。PDI和Ero1α之间形成的络合物重量，Ero1αv101克，Ero1αV109G型或Ero1α第110G页如（f）所示。指出了Ero1α、PDI和Ero1 a-PDI复合物的峰。（对于本图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的网络版。）
图4
图4
Ero1α的Val101特别参与PDI催化结构域的识别。（a） 2催化耗氧量 μM Ero1α重量或在10个 mM GSH和20 μM PDI。（b） 1催化耗氧量 μM Ero1α重量或在50 μM减少Trx1。（c） 2催化耗氧量 μM Ero1α重量或者在10人在场的情况下突变 mM GSH和60 μM ERp46。PDI、Trx1和ERp46的域组织显示在（a-c）中每个面板的顶部。（d） PDI与Ero1α相互作用的凝胶过滤分析重量，Ero1αV101G型，Ero1αW272G型或Ero1αV101G/W272G如图3f所示。（e） HEK 293中Ero1α和PDI或ERp46的共免疫沉淀 表达FLAG标记的Ero1α的T细胞或突变体。（f） 图示Ero1α的Val101和Trp272在与PDI相互作用中的作用的示意模型。突出的β发夹中的Trp272与b’PDI的结构域，而含有活性位点的外环中的Val101识别催化a’PDI域。
图5
图5
Val101突变产生减少的内质网，并损害HeLa细胞中Ero1α的氧化酶活性。（a） 390/465时荧光强度比测定ER氧化 HA标记的roGFP的nm激发急诊室在WT和两个能源监管局1AKO电池（左）。roGFP蛋白免疫印迹急诊室WT中的（HA）和Ero1α以及两者能源监管局1AKO电池（右）。（b） 390/465时荧光强度比测定ER氧化 roGFP的nm激发急诊室在里面能源监管局1A表达pcDNA3.1（模拟）、Ero1α的KO（C10）细胞重量，Ero1αV101G型或Ero1αC99A/C104A（左）。roGFP蛋白免疫印迹急诊室（HA）和Ero1α（右）。（a）和（b）中的数据显示为平均值 ± 在三个技术复制中进行的三个独立实验的SEM*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001（双尾学生t吨-测试）。（c） Myc-tagged J链（JcM）的氧化折叠。联合转染JcM和空载体（模拟）或pcDNA3.1-Ero1α-HA的WT细胞经DTT脉冲处理，并在DTT去除后的指定时间进行追踪。通过非还原性SDS-15%聚丙烯酰胺凝胶电泳和α-myc蛋白印迹分析细胞裂解产物。左边缘（左侧）显示了还原（红色）和氧化（Ox）单体、二聚体和高分子量物种（HMW）中的JcM。通过密度计量化完全还原的JcM单体的消失，并绘制为每个时间点相对于0的剩余百分比 min（右）。数据显示为平均值 ± 五个独立实验的扫描电镜***P（P） < 0.001，介于Ero1α之间重量和Ero1αV101G型（双尾学生的t吨-测试）。（d） WT和能源监管局1A稳定表达Ero1α的KO（C10）细胞重量慢病毒及其突变体。在指定浓度下用DTT处理细胞24 h，结晶紫染色可见。（对于本图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的网络版。）
图6
图6
Ero1α的Val101残基对HeLa细胞的细胞迁移、侵袭和肿瘤生长至关重要。（a） 的增长曲线能源监管局1A稳定表达Ero1α的KO（C10）细胞重量和它的突变体。数据显示为平均值 ± 三个生物复制品的扫描电镜*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01（双尾学生t吨-测试）。（b） 伤口愈合分析能源监管局1A稳定表达Ero1α的KO（C10）细胞重量和它的突变体。（c，d）跨井迁移分析（c）和跨井侵入分析（d）能源监管局1A稳定表达Ero1α的KO（C10）细胞重量和它的突变体。对滤膜底面的迁移细胞进行计数，并将其归一化为Ero1α重量数据显示为平均值 ± 在两个技术复制品中进行的三个独立实验的SEM***P（P） < 0.001（双尾学生t吨-测试）。（e） 异种移植试验能源监管局1A稳定表达Ero1α的KO（C10）细胞重量或Ero1αV101G型将细胞皮下注射到右侧（Ero1α重量)或左侧（Ero1αv101克)雌性BALB/c裸鼠的侧翼。36–41岁异种移植瘤的图像 接种后第天显示。异种移植物肿瘤的重量显示为平均值 ± 十个生物复制品的扫描电镜**P（P） < 0.01（双尾，成对学生t吨-测试）。（f） EMT相关分子在能源监管局1A稳定表达Ero1α的KO（C10）细胞重量并对其突变体进行western blotting分析。（g） H（H）2O（运行）2ER中的水平能源监管局1A稳定表达Ero1α的KO（C10）细胞重量其突变体由HyPer测定急诊室探针，添加0.5后 5的mM DTT 最小值数据显示为平均值 ± 四个技术副本的SEM**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001（双尾学生t吨-测试）。结果代表了两个独立的实验。
图7
图7
Ero1α-PDI功能相互作用在肿瘤发生中的作用。Ero1α与其伙伴PDI协同催化内质网与H的氧化蛋白折叠2O（运行）2作为副产品。Ero1α与b'xa'通过Val101识别PDI片段a’PDI域。（a） 在肿瘤细胞中，Ero1α和/或PDI高度表达，以促进肿瘤细胞生长和增殖的蛋白质折叠。Ero1α产生更多H2O（运行）2与正常细胞相比，肿瘤细胞中的ER氧化程度更高。H增加2O（运行）2氧化蛋白折叠产生更多的致癌蛋白，赋予细胞更高的迁移、转移和肿瘤发生能力。（b） Val101突变破坏Ero1α和PDI之间的相互作用，减少Ero1β催化的氧化折叠和H2O（运行）2并抑制细胞迁移、转移和肿瘤发生。
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